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[求助]
相對定量測基因相對表達(dá)量，急�。。。�
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老師要求本人測定水稻抗旱相關(guān)的20多個基因的相對表達(dá)量，有四個樣。太多了，而且樣品有限。我沒有測擴(kuò)增效率，直接用雙△法測表達(dá)量了。內(nèi)參是用的UBQ5，一個印度人寫的。現(xiàn)在遇到很多問題，用的是TAKARA的熒光定量試劑盒， 1、好幾個基因CT值都大于35，我提高了模板濃度也不行（我沒測RNA濃度，直接測cDNA濃度，然后調(diào)成與試劑盒要求的DNA的量來做）。 2、PCR反應(yīng)過程都按照說明書上設(shè)置了，沒改改動，循環(huán)數(shù)40個，因為不太會改。另外用primer5算出的溫度，還是用Oligo6算出的溫度？因為試劑盒說明書上只給出了Oligo6的溫度范圍。 3、我跑普通PCR的時候有時候沒條帶，但跑熒光的時候特異性很好。那是不是沒必要跑普通PCR了呢？不過我聽其他實驗室人說，要先跑梯度PCR，找出最適退火溫度，然后再上熒光PCR。 4、有時候有非特異性擴(kuò)增，提高溫度了還不行，是不是要換引物了？ 不好意思，本人新手不太懂，折騰了好幾千塊錢了，還沒出什么結(jié)果，很是焦急。求大神指導(dǎo)，不勝感激！��！ |
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xw19880905
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【答案】應(yīng)助回帖
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| ct值較大說明表達(dá)量低，你內(nèi)參基因表達(dá)的ct值差異大不大？如果不大就沒問題。最好用oligo6來設(shè)計引物，畢竟你做的基因太多，不好改變程序，所以設(shè)計引物時最好將溫度都設(shè)計在一個溫度左右，產(chǎn)物長度約150bp左右。非特異擴(kuò)增的引物我建議重新設(shè)計引物 |
宮保雞丁YZ2樓2012-07-19 17:18:09
3樓2012-07-19 20:50:02
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4樓2012-07-20 09:48:28
5樓2012-07-20 10:09:28
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