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[求助]
相對(duì)定量測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量，急啊�。�！
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老師要求本人測(cè)定水稻抗旱相關(guān)的20多個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，有四個(gè)樣。太多了，而且樣品有限。我沒(méi)有測(cè)擴(kuò)增效率，直接用雙△法測(cè)表達(dá)量了。內(nèi)參是用的UBQ5，一個(gè)印度人寫(xiě)的�，F(xiàn)在遇到很多問(wèn)題，用的是TAKARA的熒光定量試劑盒， 1、好幾個(gè)基因CT值都大于35，我提高了模板濃度也不行（我沒(méi)測(cè)RNA濃度，直接測(cè)cDNA濃度，然后調(diào)成與試劑盒要求的DNA的量來(lái)做）。 2、PCR反應(yīng)過(guò)程都按照說(shuō)明書(shū)上設(shè)置了，沒(méi)改改動(dòng)，循環(huán)數(shù)40個(gè)，因?yàn)椴惶珪?huì)改。另外用primer5算出的溫度，還是用Oligo6算出的溫度？因?yàn)樵噭┖姓f(shuō)明書(shū)上只給出了Oligo6的溫度范圍。 3、我跑普通PCR的時(shí)候有時(shí)候沒(méi)條帶，但跑熒光的時(shí)候特異性很好。那是不是沒(méi)必要跑普通PCR了呢？不過(guò)我聽(tīng)其他實(shí)驗(yàn)室人說(shuō)，要先跑梯度PCR，找出最適退火溫度，然后再上熒光PCR。 4、有時(shí)候有非特異性擴(kuò)增，提高溫度了還不行，是不是要換引物了？ 不好意思，本人新手不太懂，折騰了好幾千塊錢(qián)了，還沒(méi)出什么結(jié)果，很是焦急。求大神指導(dǎo)，不勝感激�。�！ |
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送鮮花一朵 
3樓2012-07-19 20:50:02
xw19880905
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-07-19 20:45:09
宮保雞丁YZ: 金幣+5, ★有幫助 2012-07-19 21:31:15
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宮保雞丁YZ: 金幣+5, ★有幫助 2012-07-19 21:31:15
| ct值較大說(shuō)明表達(dá)量低，你內(nèi)參基因表達(dá)的ct值差異大不大？如果不大就沒(méi)問(wèn)題。最好用oligo6來(lái)設(shè)計(jì)引物，畢竟你做的基因太多，不好改變程序，所以設(shè)計(jì)引物時(shí)最好將溫度都設(shè)計(jì)在一個(gè)溫度左右，產(chǎn)物長(zhǎng)度約150bp左右。非特異擴(kuò)增的引物我建議重新設(shè)計(jì)引物 |
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2樓2012-07-19 17:18:09
xw19880905
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4樓2012-07-20 09:48:28
5樓2012-07-20 10:09:28
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