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[交流] 雙酶切后載體片段變小

本人實(shí)驗(yàn)中遇到點(diǎn)問題，現(xiàn)將詳細(xì)過程書寫如下，并附帶詳細(xì)的參考信息。
目的基因長度：900bp
目的基因的前端有NdeI酶切位點(diǎn)，后端有BamHI酶切位點(diǎn)。目的基因是由公司合成好以后構(gòu)建到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α中。
pET3a（大小4640bp） pET20b（大小3716bp）以及pGEM-T（大小3000bp）都是轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取質(zhì)粒以后做雙酶切的時(shí)候都載體的大小正確（如圖1），可以排除同源重組的可能性。

圖1
（圖1）提取質(zhì)粒后做雙酶切，從圖中可以看到pET3a和pT-taget質(zhì)粒都已經(jīng)完全切開，且載體與目的基因的大小都正確。注：pT-taget雙酶切以后載體有兩條帶，這是因?yàn)槟康幕蚝蚑載體上都帶有NdeI酶切位點(diǎn)，目的基因的末端A與T載體的T相連時(shí)存在正反向相連兩種情況，目的基因大小為900bp左右，所以在沒有完全切開質(zhì)粒的時(shí)候載體會與兩種情況，大小相差900bp左右。

圖2
（圖2）目的基因雙酶切后分別與pET3a和pET20b相連接，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，挑取單克隆提質(zhì)粒雙酶切后的電泳結(jié)果。圖中用DH5α中提取的pET3a和pET20b質(zhì)粒做的雙酶切作為載體的對照；連接后雙酶切目的基因的條帶大小正確，但載體的大小發(fā)生改變，都比原先載體片段小。
我的問題就是，為什么連接了以后原先的載體會變�。ㄒ呀�(jīng)重復(fù)了多次實(shí)驗(yàn)，更換了感受態(tài)細(xì)胞，重新提質(zhì)粒，重新酶切的載體等等）。

圖3
（圖3）pET3a-target與pET20b-target分別用NdeI和BamHI做單酶切；3a加目的基因條帶應(yīng)該在5000左右，處于Marker10000中從上數(shù)第三條帶4000以上，然而切出來的條帶位于4000一下；同樣，20b載體單酶切后加上目的條帶也應(yīng)在4000以上。

總的來說，目的基因連入載體以后，載體序列酶切后發(fā)生的構(gòu)象的改變，導(dǎo)致條帶位置發(fā)生改變，請問這具體的原因是什么呢？

pGEM-T

pET-3a

pET-20b

[ Last edited by shoppinggirl on 2012-8-18 at 19:13 ]

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1樓 2012-08-18 09:05:06

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原始載體兩個(gè)酶切位點(diǎn)間想多多少BP呢

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2樓2012-08-19 13:59:08

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我也遇到過這樣的問題，后來重新酶切做了一次就好了。

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3樓2012-08-19 19:05:07

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2樓: Originally posted by taojun at 2012-08-19 13:59:08
原始載體兩個(gè)酶切位點(diǎn)間想多多少BP呢

就多 30幾個(gè)bp

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4樓2012-08-20 00:20:55

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3樓: Originally posted by zhangj0754 at 2012-08-19 19:05:07
我也遇到過這樣的問題，后來重新酶切做了一次就好了。

我已經(jīng)重新酶切了三遍以上了，都是這個(gè)結(jié)果，這里的圖片是比較好看的，我選出來放上去的。

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5樓2012-08-20 00:21:40

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3樓: Originally posted by zhangj0754 at 2012-08-19 19:05:07
我也遇到過這樣的問題，后來重新酶切做了一次就好了。

兩個(gè)酶切位點(diǎn)相差這么少啊，你跑焦的時(shí)候用2%的膠試試�。�

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6樓2012-08-20 12:52:00

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你好，這個(gè)問題解決了嗎？怎么解決的哈，我也遇到了同樣的問題哈，載體變小了

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7樓2015-03-19 16:39:24

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我也遇到了這種情況，請問是否是六樓所說的膠的問題呢，期待您的回復(fù)。。。謝謝

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8樓2015-09-22 17:06:04

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8樓: Originally posted by 99蝸牛99 at 2015-09-22 17:06:04
我也遇到了這種情況，請問是否是六樓所說的膠的問題呢，期待您的回復(fù)。。。謝謝

你用2％的膠跑電泳了嗎

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9樓2019-06-03 21:11:43

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