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知音者2新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，求高手解答
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體系：2xmix 12.5ul,引物（Im26-f,Im3r）各0.5ul，ddw10.5，模版200ng，1ul。程序94 5min，94 30s，56 30s，72 60s，72 7min，30個循環(huán)。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，求高手解答 |
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xiayongxiu
金蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應(yīng)助，很熱心哈 2012-08-27 13:42:37
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應(yīng)助，很熱心哈 2012-08-27 13:42:37
| 首先，確定你的非特異性帶是怎么來的，也就是簡單地做一個無模板對照，一般做PCR最后做一個陰性對照和陽性對照，看你的操作是否有誤或者試劑有無污染之類的，如果是你比較成熟的體系，可以不做對照，但是如果是剛開始一個新的程序，最好還是做個陰性對照，排除是水或者試劑的污染造成的非特性帶，然后才是看是否由于退火溫度引起的。一般情況下PCR的退火溫度要根據(jù)你的引物Tm值來確定，一般是比引物Tm值低3度左右，當(dāng)然有的高保真酶是要求比引物Tm值高；有非特異性條帶的另一種可能是你設(shè)計的引物剛好在基因組其他地方也能擴(kuò)增，也就是引物的特異性不是很好，你設(shè)計好引物后，可以先Blast一下。希望能幫助你。 |
7樓2012-08-26 19:20:51
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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2樓2012-08-25 11:47:03
chenguestc
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3樓2012-08-25 15:01:50
知音者2
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4樓2012-08-25 16:48:41
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