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hzxm0316鐵蟲 (初入文壇)
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轉(zhuǎn)化后菌液PCR鑒定，沒(méi)有目的條帶
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PCR時(shí)得到目的片段800bp，亮且單一，可是連接轉(zhuǎn)化后，再菌液PCR鑒定，卻始終只有200bp左右的條帶，是怎么回事��？有兩次菌液鑒定得到800bp的單一亮條帶，可是將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI比對(duì)，卻是沒(méi)有找到相似序列？為什么就是轉(zhuǎn)化不出目的序列呢？哪位大俠路過(guò)，請(qǐng)幫忙解答，謝謝！ （載體為PUCm-T Vecter；宿主為E.coli 5a） （菌液鑒定：M13通用引物） 實(shí)驗(yàn)均按照生工生物T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒上規(guī)定操作 |
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone: 回帖置頂 2012-08-31 07:24:17
1949stone: MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
1949stone: MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
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如果分子量都不對(duì)，那我覺(jué)得是從最開(kāi)始找問(wèn)題應(yīng)該，每一步都CHECK一下。 PCR之后，跑膠，請(qǐng)加MARKER標(biāo)定PCR產(chǎn)物分子量。 回收之后，請(qǐng)把回收產(chǎn)物用2-3微升跑膠，看分子量是否正確。 如果正確，連接轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化后涂平板，培養(yǎng)，挑取單克隆。 單克隆菌液同時(shí)用通用引物及你的特異引物做PCR驗(yàn)證分子量是否正確。 如果正確就大量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序。 如果你們自己有測(cè)序儀，可以用純化的PCR產(chǎn)物來(lái)測(cè)序，前提是分子量是正確的話。 |
9樓2012-08-31 06:53:28
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