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hzxm0316鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
轉(zhuǎn)化后菌液PCR鑒定，沒有目的條帶
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PCR時得到目的片段800bp，亮且單一，可是連接轉(zhuǎn)化后，再菌液PCR鑒定，卻始終只有200bp左右的條帶，是怎么回事��？有兩次菌液鑒定得到800bp的單一亮條帶，可是將測序結(jié)果提交到NCBI比對，卻是沒有找到相似序列？為什么就是轉(zhuǎn)化不出目的序列呢？哪位大俠路過，請幫忙解答，謝謝！ （載體為PUCm-T Vecter；宿主為E.coli 5a） （菌液鑒定：M13通用引物） 實驗均按照生工生物T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒上規(guī)定操作 |
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chenguestc
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone: 回帖置頂 2012-08-31 07:24:17
1949stone: MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
1949stone: MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
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如果分子量都不對，那我覺得是從最開始找問題應(yīng)該，每一步都CHECK一下。 PCR之后，跑膠，請加MARKER標定PCR產(chǎn)物分子量。 回收之后，請把回收產(chǎn)物用2-3微升跑膠，看分子量是否正確。 如果正確，連接轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化后涂平板，培養(yǎng)，挑取單克隆。 單克隆菌液同時用通用引物及你的特異引物做PCR驗證分子量是否正確。 如果正確就大量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序。 如果你們自己有測序儀，可以用純化的PCR產(chǎn)物來測序，前提是分子量是正確的話。 |
9樓2012-08-31 06:53:28
2樓2012-08-30 09:58:02
gwd0312
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3樓2012-08-30 10:14:59
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5樓2012-08-30 13:12:12
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