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yu棒棒新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PET-30a 雙酶切
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本人最近在做PET-30a的ECOR I 和NOT I的雙酶切，可是做了好多次都沒有成功，酶切后跑電泳仍是一條帶，不知道是什么問題出了錯(cuò)，請(qǐng)高手指點(diǎn)下。 酶切體系如下： 5ul 質(zhì)粒 1ul 10*H 1ul BSA 0.5ul ECOR I 0.5ul NOT I 2ul H2O 酶切條件嘗試過37度兩小時(shí)，37度三小時(shí)，還嘗試過37度過夜。 現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)無法繼續(xù)，跪求前輩指點(diǎn)，謝謝！ |
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冰風(fēng)顫木
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5樓2013-06-18 22:18:14
zhwenxing
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1、雙酶切，一般做：酶1單切，酶2單切，雙酶切，不酶切，跑膠時(shí)候能夠?qū)φ眨踔劣昧硗庖环N常用的酶X單酶切，若X在插入片段有切點(diǎn)，而在載體上沒有切點(diǎn)，就能知道你連接進(jìn)去啦； 2、不知樓主采用的是什么牌子的RE？是TaKaRa的嗎？Fermentas的快速酶切很好用；不論哪個(gè)牌子的，都可以。此常用載體不需要過夜酶切，時(shí)間長了還產(chǎn)生星活性呢！ 3、 “5 ul”質(zhì)粒這種說法希望以后就別再出現(xiàn)了，質(zhì)粒的濃度不一樣、大小不一樣，mol數(shù)量太模糊了！注意不要加入太多的質(zhì)粒，再就是質(zhì)粒洗脫時(shí)注意用量，去除乙醇等的影響。 4、 可PCR先檢測(cè)一下插入片段連進(jìn)去了沒有？ 5、酶切體系不要擴(kuò)大，雙酶切時(shí)候，酶的用量要減少，我一般是0.5-0.7ul足以，常用的這些RE活性了得。 嘗試一下吧~吼吼，希望對(duì)你有用。 |
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yu棒棒2樓2012-10-30 15:14:03
yu棒棒
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4樓2012-10-31 08:16:02
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