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生化與分子新蟲 (初入文壇)
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[求助]
目的基因片段膠回收后酶切，然后再跑膠后發(fā)現(xiàn)條帶很弱，怎么改進(jìn)（求助）
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| 我要做目的基因的超表達(dá)，構(gòu)建載體的第一步就遇到了困難，我在克隆了目的基因跑膠后做雙酶切，然后再跑膠，發(fā)現(xiàn)目的條帶很弱，根本沒(méi)有回收的必要了，怎么改進(jìn)才能得到較亮的酶切條帶？請(qǐng)各位幫忙提點(diǎn)兒建議，不勝感激！ |
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2樓2012-10-31 07:37:21
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-31 15:18:04
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-31 15:18:04
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個(gè)人建議，僅供參考！ 1.擴(kuò)增之后直接進(jìn)行酶切，然后再對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收； 2.膠回收效率本來(lái)就很低，無(wú)論是國(guó)產(chǎn)還是進(jìn)口的試劑盒，反復(fù)膠回收肯定量很少； 3.我之前用過(guò)Omega的試劑盒，感覺不錯(cuò)； 4.膠回收最后的一步可以更換為ddH2O，更有益于克隆。 |
3樓2012-10-31 10:34:16
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4樓2012-10-31 11:06:14
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-10-31 15:18:42
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-10-31 15:18:42
| 兩種解決方案：1.一般來(lái)說(shuō)如果PCR產(chǎn)物是單一條帶的話，可以直接PCR產(chǎn)物回收，然后做雙酶切，這樣又簡(jiǎn)單產(chǎn)率也很高而且可以避免更多的突變產(chǎn)生。如果你的目的基因是在文庫(kù)中拉的話那么其實(shí)第二步也可以直接產(chǎn)物回收的。2.如果擔(dān)心純度問(wèn)題的話，最好還是割膠回收，但是呢，要加大PCR的量，而且在膠回收的過(guò)程中可以適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，比如說(shuō)膠回收在過(guò)柱子的過(guò)程中可以反復(fù)過(guò)濾3遍，提高產(chǎn)率，DDH2O少加一點(diǎn)，也可以的。 |
5樓2012-10-31 13:19:25
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myprayer: 金幣+1, 屏蔽內(nèi)容, 應(yīng)樓主要求，屏蔽咯 2013-05-12 15:55:45
myprayer: 金幣+1, 屏蔽內(nèi)容, 應(yīng)樓主要求，屏蔽咯 2013-05-12 15:55:45
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
6樓2013-05-12 10:12:31
7樓2013-06-11 19:30:17
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yayasci
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9樓2013-12-08 22:18:57
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