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[求助]
多個基因共表達(dá)純化問題
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請教共表達(dá)兩個基因以及表達(dá)后如何純化。具體為 兩個基因都有完整閱讀框，之間加有rbs，如何連接到pet28，能實現(xiàn)共表達(dá)嗎？ 另外，就是如果共表達(dá)了，第一個蛋白可以利用載體的His標(biāo)簽純化，那第二個也能純化嗎？如果不能，是不是應(yīng)該在它前面加上His標(biāo)簽?zāi)兀? |
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xiangquanju
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你的意思是把兩個基因放在一個克隆位點里面？ 如果這這樣的話，可以通過在引物上加限制性內(nèi)切酶來完成，也就是說放在前面的基因的下游引物和放在后面的上游引物的酶切位點一樣，先把其中一個基因出入到多克隆位點區(qū)，再插入第二個！ 我之前有這樣做過和GST的共表達(dá)，把GST放后面的，但是最后表達(dá)出來的大部分都是GST,要么都是包涵體，聽一個師兄說因為兩個基因挨得太近，可能需要在兩個基因之間加一個linker，但是具體這個linker怎么加，我也不是很清楚 |
12樓2012-12-03 13:18:01
2樓2012-11-29 11:43:58
susizheng
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1、連接的話，先連接A基因到pet28，B基因借助另外一個載體，連接后，擴(kuò)增RBS-B基因進(jìn)行第二次連接； 2、T7啟動子共表達(dá)兩個基因沒問題。 3、共表達(dá)主要是做催化用的，做純化沒必要共表達(dá)吧。分開表達(dá)純化不是更好？ 如果確實像同時純化也行，在擴(kuò)增第二個基因的引物上加上his標(biāo)簽就行。 |
3樓2012-11-29 13:55:08
4樓2012-11-29 15:04:24
5樓2012-11-29 15:12:45
susizheng
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xiangquanju
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首先樓主要明白共表達(dá)的目的是什么，有些是為了研究蛋白之間的相互作用，有些是為了保證蛋白的正確折疊，需要供表達(dá)另外一個蛋白 共表達(dá)可以選擇共表達(dá)載體（progema公司有很多），把不同的基因插入到不同的多克隆位點。一般只會在其中一個基因上插入一個純化標(biāo)簽，然后通過蛋白質(zhì)之間的相互作用純化將另外一個蛋白也純化了。 如果樓主擔(dān)心標(biāo)簽最蛋白的活性有影響，可以在蛋白與標(biāo)簽之間加入一個蛋白酶酶切位點，如TEV，純化之后用這個蛋白酶切除標(biāo)簽就可以了 |
8樓2012-12-01 20:42:49
9樓2012-12-02 09:27:54
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10樓2012-12-02 10:33:57
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