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單酶切的大片段連接轉(zhuǎn)化及多個(gè)片段的連接轉(zhuǎn)化問(wèn)題
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最近做的幾個(gè)克隆都非常不順，一個(gè)多月了，天天連接轉(zhuǎn)化涂板，天天收的空白板 一個(gè)涉及到多片段的連接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb 另一個(gè)是大片段單酶切連接（Pac I)：6.7kb+12kb 一直是懷疑連接的效率問(wèn)題，單轉(zhuǎn)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照確定感受態(tài)是好的。 具體：（1）多片段連接：確定多片段連接中的幾個(gè)片段都是酶切徹底的，跑膠，切膠做回收，用的QIAGEN的膠回收試劑盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后濃度僅達(dá)20ng/ul。回收后片段做連接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速連接試劑盒也有試過(guò)，均按說(shuō)明操作（普通連接酶：10ul體系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室溫過(guò)夜后轉(zhuǎn)16度；快速連接試劑盒：同上一樣的體系，室溫5分鐘），均未有單菌落生長(zhǎng)。 （2）大片段連接：6.7kb的insert質(zhì)粒和12kb載體質(zhì)粒均用PacI進(jìn)行酶切，酶切后跑膠回收，載體片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也僅十幾ng/ul，同樣的用NEB的T4 DNA ligase做連接，10ul體系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室溫過(guò)夜后轉(zhuǎn)16度，未見(jiàn)有單克隆生長(zhǎng)。 這段時(shí)間全耗在連接轉(zhuǎn)化上面了，嚴(yán)重打擊了我科研的信心  想求助一下大家在多片段的連接或大片段的連接轉(zhuǎn)化中都需要注意哪方面的問(wèn)題呢？有大牛幫忙分析分析失敗的原因嗎？ |
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whs1230
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7樓2013-10-30 19:21:12
gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主的第一個(gè)克隆難度的確是蠻大的，第二個(gè)還好， 1. 根據(jù)你的描述，總是空板，你有沒(méi)有測(cè)試過(guò)你轉(zhuǎn)化時(shí)用的感受態(tài)的效率，因?yàn)槟闶嵌嗥魏痛笃芜B接，對(duì)感受態(tài)效率還是有一定要求的，最好用那種超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化比較好，因此，你首先測(cè)試下你的感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)用個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)試你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用錯(cuò)抗性平板了 2. 對(duì)于第一個(gè)多片段克隆，片段是不是太多了點(diǎn)，而且你是PCR產(chǎn)物直接酶切，你可以先把片段連上T-載體等中間載體，然后再酶切回收回來(lái)，這樣保證每一個(gè)片段都被充分酶切開(kāi)，然后再多片段連試試 3.對(duì)于第一個(gè)多片段連接，樓主是不是也可考慮用Overlap PCR的方法，先把四個(gè)片段拼接為一個(gè)片段再往載體上連 4. 你大片段連接的過(guò)程和體系都是沒(méi)有問(wèn)題的，但是你總是連接不上，會(huì)不會(huì)是所用連接酶有問(wèn)題？ 5. 不知道樓主大片段連接是，載體單酶切后有沒(méi)有進(jìn)行去磷酸化，如果沒(méi)有的話，連接后，板子上應(yīng)該會(huì)長(zhǎng)很多克隆才對(duì)，這是載體自連導(dǎo)致的，是板子的問(wèn)題還是感受態(tài)的問(wèn)題，樓主可以排查一下 [ Last edited by gyesang on 2012-12-19 at 23:57 ] |
2樓2012-12-06 18:19:42
serena08
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首先非常感謝gyesang的熱心回帖！一早我就上來(lái)看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的問(wèn)題，我一一做個(gè)排查： 1. 做過(guò)單轉(zhuǎn)質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照，雖然沒(méi)有每次都有這個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，但開(kāi)始的時(shí)候是確定過(guò)抗性是對(duì)的，轉(zhuǎn)質(zhì)粒效率是沒(méi)有太大問(wèn)題的，至于是不是超級(jí)感受態(tài)我真不敢肯定，用的是全式金的Trans-T1； 2. 對(duì)于第一個(gè)多片段，四個(gè)片段均不是PCR后直接酶切，都是從質(zhì)粒上酶切下來(lái)的...... 其中，前兩個(gè)700bp左右的是insert，最初也是PCR酶切，但后來(lái)也是為了排除PCR酶切可能不完全，所以又先構(gòu)到T載體中做了酶切回收，而后兩個(gè)3.6+1.6kb的片段是載體片段中切下來(lái)的，所以能確定待連接的片段酶切是完全的； 3. overlap PCR的方法沒(méi)做過(guò)，不知道是否可行，實(shí)現(xiàn)起來(lái)難度有多大？ 4. 連接酶是NEB的T4，之前訂的都被我用完了，所以最近做的這幾次是用的新訂的一支，可以考慮做個(gè)常規(guī)的連接排查一下連接酶的問(wèn)題，先準(zhǔn)備訂個(gè)fermentas的連接酶試試； 5. 您這個(gè)問(wèn)題真是問(wèn)到我心里去了，這個(gè)問(wèn)題也非常困擾我，載體單酶切后并沒(méi)有做去磷酸化處理，為何連自連的都沒(méi)有能？？板子和感受態(tài)都有空轉(zhuǎn)質(zhì)粒載體的對(duì)照，確定沒(méi)問(wèn)題。那么就是連接酶了。。。 另外，有推薦使用的超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞嗎？國(guó)外品牌的沒(méi)法進(jìn)口，但國(guó)內(nèi)的不清楚哪家的感受態(tài)做得最好？以前都是做的常規(guī)克隆，所以也沒(méi)遇到過(guò)這么多問(wèn)題，請(qǐng)大家多交流指教了！ |
3樓2012-12-07 08:23:25
gyesang
無(wú)蟲
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1. 關(guān)于你的第一個(gè)克隆，我強(qiáng)烈建議你先用Overlap PCR的方法把片段連好，再往載體上構(gòu)建，從時(shí)間上， 比你在那撞運(yùn)氣式的四片段連接肯定會(huì)快很多，主要缺點(diǎn)就是需要合成引物，浪費(fèi)錢，但為了實(shí)驗(yàn)，我們不在乎這點(diǎn)錢 2. 載體單酶切后并沒(méi)有做去磷酸化處理，且沒(méi)有自連，而且你的板子和感受態(tài)也驗(yàn)證沒(méi)有問(wèn)題，那你需要考慮換連接酶了，這里給你個(gè)推薦（絕對(duì)非廣告，因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)室一直用，就是覺(jué)的還可以），你可以去查查toyobo公司的ligation high這個(gè)連接酶 3. 關(guān)于感受態(tài)，我沒(méi)有什么建議的，我們都是實(shí)驗(yàn)室自己做的感受態(tài)，專門人負(fù)責(zé)的，可能是經(jīng)常做的緣故吧，都到了如火純清的地步了，感受態(tài)基本沒(méi)出現(xiàn)過(guò)問(wèn)題，且好用，至于哪個(gè)公司賣，還真不清楚 |
4樓2012-12-08 21:32:10
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