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火舞精靈3銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
連接！轉(zhuǎn)化！出問(wèn)題了�。。�！
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我做的連接轉(zhuǎn)化，后提質(zhì)粒，利用T載體鑒定試劑盒檢測(cè)，如圖。 目的基因大約是2000bp，連接載體是Promoge載體pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化菌株是JM109菌種 連接后，凍融法轉(zhuǎn)化JM109，涂Amp，IPTG, X-gal 平板。 問(wèn)題1. 出現(xiàn)了，平板全是白斑沒(méi)有藍(lán)斑�。。≒romoge載體自連很?chē)?yán)重，但卻沒(méi)有了，而且前段時(shí)間是有藍(lán)白斑的，就在這一個(gè)月沒(méi)有藍(lán)斑只有白斑，不但我的實(shí)驗(yàn)是這樣，整個(gè)實(shí)驗(yàn)室全是白斑，沒(méi)有藍(lán)斑） 問(wèn)題2. 我提質(zhì)粒顯示確是1500的條帶（載體大約3000bp），目的基因PCR檢測(cè)是空白，證明是空載體！！用T載體鑒定試劑盒檢測(cè)（SP6/T7引物檢測(cè)）的確是空載體（250bp左右），也同樣可以排除1500是細(xì)菌基因組DNA的可能性。 求解�。�！   212.jpg |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
火舞精靈3: 金幣+5 2012-12-29 08:53:02
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
火舞精靈3: 金幣+5 2012-12-29 08:53:02
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1：看電泳，你提出來(lái)的質(zhì)粒大小根本不對(duì)，3000的質(zhì)粒+2000的目的條帶，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，環(huán)形質(zhì)粒跑出來(lái)差不多在3000多點(diǎn)的位置，猜測(cè)你提出來(lái)的這個(gè)是大腸桿菌的基因組碎片. 2：你用了一對(duì)T載體上的引物做了一個(gè)質(zhì)粒PCR？是吧.其實(shí)PCR這個(gè)東西用來(lái)作驗(yàn)證是非常不可靠的，可還是很多人喜歡用這個(gè)方法，前幾天我一師弟做了16管PCR驗(yàn)證，結(jié)果非常漂亮，但是提質(zhì)粒酶切了，全是假陽(yáng)性.既然你都提質(zhì)粒了，何不直接單酶切一下，簡(jiǎn)單準(zhǔn)確. 3：藍(lán)白斑，這個(gè)已經(jīng)被我們實(shí)驗(yàn)室拋棄很久的方法了，一直用的TAKARA的pMD19-T配合它們家的DH5α，陽(yáng)性率很可觀，隨便挑幾個(gè)菌落基本9成是陽(yáng)性. PS:好運(yùn). |
23樓2012-12-26 15:23:31
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