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[交流]
連接！轉(zhuǎn)化！出問題了�。。。�
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我做的連接轉(zhuǎn)化，后提質(zhì)粒，利用T載體鑒定試劑盒檢測，如圖。 目的基因大約是2000bp，連接載體是Promoge載體pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化菌株是JM109菌種 連接后，凍融法轉(zhuǎn)化JM109，涂Amp，IPTG, X-gal 平板。 問題1. 出現(xiàn)了，平板全是白斑沒有藍斑！�。≒romoge載體自連很嚴重，但卻沒有了，而且前段時間是有藍白斑的，就在這一個月沒有藍斑只有白斑，不但我的實驗是這樣，整個實驗室全是白斑，沒有藍斑） 問題2. 我提質(zhì)粒顯示確是1500的條帶（載體大約3000bp），目的基因PCR檢測是空白，證明是空載體�。∮肨載體鑒定試劑盒檢測（SP6/T7引物檢測）的確是空載體（250bp左右），也同樣可以排除1500是細菌基因組DNA的可能性。 求解！��！   212.jpg |
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22樓2012-12-26 12:36:23
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
火舞精靈3: 金幣+5 2012-12-29 08:53:02
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
火舞精靈3: 金幣+5 2012-12-29 08:53:02
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1：看電泳，你提出來的質(zhì)粒大小根本不對，3000的質(zhì)粒+2000的目的條帶，根據(jù)經(jīng)驗，環(huán)形質(zhì)粒跑出來差不多在3000多點的位置，猜測你提出來的這個是大腸桿菌的基因組碎片. 2：你用了一對T載體上的引物做了一個質(zhì)粒PCR？是吧.其實PCR這個東西用來作驗證是非常不可靠的，可還是很多人喜歡用這個方法，前幾天我一師弟做了16管PCR驗證，結(jié)果非常漂亮，但是提質(zhì)粒酶切了，全是假陽性.既然你都提質(zhì)粒了，何不直接單酶切一下，簡單準確. 3：藍白斑，這個已經(jīng)被我們實驗室拋棄很久的方法了，一直用的TAKARA的pMD19-T配合它們家的DH5α，陽性率很可觀，隨便挑幾個菌落基本9成是陽性. PS:好運. |
23樓2012-12-26 15:23:31
25樓2013-01-24 19:21:59
簡單回復
釹鐵硼20樓
2012-12-21 09:54
回復
su-b0824樓
2012-12-26 17:51
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