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火舞精靈3

銅蟲 (正式寫手)

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[交流] 連接！轉(zhuǎn)化！出問(wèn)題了�。。。�

我做的連接轉(zhuǎn)化，后提質(zhì)粒，利用T載體鑒定試劑盒檢測(cè)，如圖。
目的基因大約是2000bp，連接載體是Promoge載體pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化菌株是JM109菌種
連接后，凍融法轉(zhuǎn)化JM109，涂Amp，IPTG, X-gal 平板。
問(wèn)題1. 出現(xiàn)了，平板全是白斑沒(méi)有藍(lán)斑�。。≒romoge載體自連很嚴(yán)重，但卻沒(méi)有了，而且前段時(shí)間是有藍(lán)白斑的，就在這一個(gè)月沒(méi)有藍(lán)斑只有白斑，不但我的實(shí)驗(yàn)是這樣，整個(gè)實(shí)驗(yàn)室全是白斑，沒(méi)有藍(lán)斑）

問(wèn)題2. 我提質(zhì)粒顯示確是1500的條帶（載體大約3000bp），目的基因PCR檢測(cè)是空白，證明是空載體！！用T載體鑒定試劑盒檢測(cè)（SP6/T7引物檢測(cè)）的確是空載體（250bp左右），也同樣可以排除1500是細(xì)菌基因組DNA的可能性。

求解�。。�

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1樓 2012-12-19 13:15:28

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小木蟲劉樹(shù)青

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25樓2013-01-24 19:21:59

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笑笑天涯

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左邊的Marker是lamda Hind3?
這個(gè)質(zhì)�？粗艽蟀�,為什么不拿酶單切下呢?
2kb稍稍有點(diǎn)大,但是還是連得上的,但是連接效率會(huì)低一點(diǎn)
連接不上的可能能也有,還要看連接酶效率

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2樓2012-12-19 15:05:09

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 笑笑天涯 at 2012-12-19 15:05:09
左邊的Marker是lamda Hind3?
這個(gè)質(zhì)�？粗艽蟀�,為什么不拿酶單切下呢?
2kb稍稍有點(diǎn)大,但是還是連得上的,但是連接效率會(huì)低一點(diǎn)
連接不上的可能能也有,還要看連接酶效率

左邊Marker是LD15000

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3樓2012-12-19 15:51:49

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望海思月

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是不是你們實(shí)驗(yàn)室IPTG, X-gal出問(wèn)題了，檢測(cè)不出來(lái)，恰好你挑的那幾個(gè)轉(zhuǎn)化子是空連的

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4樓2012-12-19 16:21:19

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