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[求助] Western Blot結(jié)果條帶中間不見了，請(qǐng)教高手！

第一次A樣本，用B抗體曝光如下圖：

第二次B樣本，用同樣的B抗體曝光出現(xiàn)了2條帶，好像是中空的，兩次的二抗?jié)舛榷际且粯拥�，都�?:5000，可能是有些高，但是為啥第一次曝光就沒(méi)事呢？

請(qǐng)教各位高手

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1樓 2013-02-01 22:05:20

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ccharlien

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wizardfan: 金幣+1, 謝謝參與 2013-02-03 09:33:55

第一次的曝光時(shí)間太長(zhǎng)了
曝光要在看的出各泳道差異的情況下盡量淺一些
第二次的沒(méi)問(wèn)題
可能是抗體特異性/蛋白異構(gòu)體/降解/修飾各種原因

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4樓2013-02-02 20:31:30

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cicelyzh

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western這種半定量的實(shí)驗(yàn)需要在信號(hào)為飽和時(shí)比較。暴光過(guò)久導(dǎo)致部分信號(hào)飽和，比出來(lái)的結(jié)果也不好說(shuō)明什么問(wèn)題。
一種蛋白可能會(huì)有各種修飾，電泳時(shí)跑出不同條帶也是正常的。單克隆抗體是一個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生出來(lái)的抗體，總體上說(shuō)比多克隆抗體的特異性會(huì)好一些。但是單克隆抗體也是有可能識(shí)別不同蛋白的。所以，不要以為單抗出來(lái)就一定是一條帶。

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7樓2013-02-03 09:28:29

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cicelyzh

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wizardfan: 金幣+2, 謝謝分析，歡迎交流 2013-02-03 09:32:08

問(wèn)題可能有兩種情況：
一：本身應(yīng)該是一條帶，由于電泳、轉(zhuǎn)膜或者暴光膠片等原因，出現(xiàn)兩條帶。
二：抗體識(shí)別分子量接近的兩條帶，第一次由于抗體過(guò)強(qiáng)或者是電泳的原因，兩條帶沒(méi)有分開。
我感覺第二種情況的可能性更大一些。

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2樓2013-02-02 12:12:22

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引用回帖:

2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-02 12:12:22
問(wèn)題可能有兩種情況：
一：本身應(yīng)該是一條帶，由于電泳、轉(zhuǎn)膜或者暴光膠片等原因，出現(xiàn)兩條帶。
二：抗體識(shí)別分子量接近的兩條帶，第一次由于抗體過(guò)強(qiáng)或者是電泳的原因，兩條帶沒(méi)有分開。
我感覺第二種情況的可能 ...

一抗為單克隆抗體，本身應(yīng)該為一條帶；
電泳、轉(zhuǎn)膜都沒(méi)問(wèn)題，其他一起的內(nèi)參背景較濃，很可能是二抗?jié)舛却蠡蛘邲](méi)洗好的原因；
曝光時(shí)間短或者長(zhǎng)都是這個(gè)情況；
馬上要回家了，也來(lái)不及驗(yàn)證了

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3樓2013-02-02 12:53:17

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引用回帖:

4樓: Originally posted by ccharlien at 2013-02-02 20:31:30
第一次的曝光時(shí)間太長(zhǎng)了
曝光要在看的出各泳道差異的情況下盡量淺一些
第二次的沒(méi)問(wèn)題
可能是抗體特異性/蛋白異構(gòu)體/降解/修飾各種原因

如果曝光太淺，雖然也有差異，畢竟不好看；
抗體單克隆，“各種原因”實(shí)在難以想象，不知有沒(méi)有同學(xué)有過(guò)類似情況

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5樓2013-02-02 23:05:58

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引用回帖:

5樓: Originally posted by 格子和瀟瀟 at 2013-02-02 23:05:58
如果曝光太淺，雖然也有差異，畢竟不好看；
抗體單克隆，“各種原因”實(shí)在難以想象，不知有沒(méi)有同學(xué)有過(guò)類似情況...

不復(fù)雜的問(wèn)題，告訴你這些可能的原因你不當(dāng)回事我也沒(méi)辦法了
單抗和是不是一條帶沒(méi)有多大關(guān)系，你可以多了解一些單抗的相關(guān)知識(shí)

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6樓2013-02-03 04:28:33

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我覺得可能還與你檢測(cè)的蛋白類型有關(guān)，是不是存在蛋白復(fù)合物？

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8樓2013-02-04 09:28:36

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我看你說(shuō)兩次蛋白樣品不一樣，你是不是可以嘗試再用A樣品做一次呢。
我感覺有可能是你的蛋白存在一些修飾，使它分子量產(chǎn)生了變化吧？只是可能啊

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9樓2013-02-04 15:18:22

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這個(gè)問(wèn)題我遇到過(guò)，呵呵，樓上說(shuō)的很對(duì)，不同的蛋白修飾，不同的細(xì)胞分泌出來(lái)的蛋白序列一樣但糖基修飾可能不一樣

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