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釀酒酵母的電轉(zhuǎn)方法
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想請(qǐng)教一下釀酒酵母和畢赤酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備有什么區(qū)別嗎？ 我們實(shí)驗(yàn)室只有釀酒酵母，可是我只找到了畢赤酵母感受態(tài)的制備方式，不知道能不能通用呢？ 一下是畢赤酵母感受態(tài)的制備方法： 1)在含 5mlYPD 的 50ml 離心管中，培養(yǎng)畢赤酵母，30 度過夜 2)取 0.1-0.5ml 過夜培養(yǎng)物，接種含 500ml 新鮮培養(yǎng)基的 2L 搖瓶，過夜生長至 OD600＝1.3-1.5 3)4 度，1500g離心 5min收集細(xì)胞，用 500ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞 4)如上離心，用 250 ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞 5)如上離心，用 20ml預(yù)冷的 1M山梨醇懸浮細(xì)胞 6)如上離心，用 1 ml 預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml 注意：可凍存80ul 等量的電感受態(tài)細(xì)胞，但轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降很多 小女子先謝謝各位大神了��！ |
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greenhope3371
銅蟲 (正式寫手)
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2樓2013-03-26 14:44:26
cory0931
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
qing1220(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-04-27 14:52:31
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
qing1220(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-04-27 14:52:31
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我后期也計(jì)劃采用畢赤酵母表達(dá)，個(gè)人覺得值得一試； 另外附上復(fù)旦大學(xué)一哥們學(xué)位論文中的一段描述，粘貼有個(gè)別字跡錯(cuò)誤，最好自己下載原文參考； 《同源重組技術(shù)在釀酒酵母表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用》 2004年 酵母LiAC轉(zhuǎn)化法[421 接種釀酒酵母單菌落在3mLYEPD培養(yǎng)基中30。C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。 將過夜培養(yǎng)物稀釋轉(zhuǎn)接到50mLYEPD培養(yǎng)基中，使得細(xì)胞密度為5×106個(gè)／n1L。 30。C、250rpm培養(yǎng)5～7hr，使得細(xì)胞培養(yǎng)至2×107個(gè)／mL(細(xì)胞在此期叫繁殖兩 代)，5，000rpm、5min離心收集菌體。棄上清，用20mL無菌水懸浮菌體。 5,000rpm、5rain離心收集菌體。棄上清，將菌體懸浮于10mL 0．1M LiAC中， 30。C水浴10rain。5，000rpm、5min離心收集菌體。棄上清，加入1 mL 0．IM LiAC， 混勻，使得細(xì)胞終濃度為1×109個(gè)／mL(此即為制備好的感受態(tài)細(xì)胞)。 吸取100I_tL 菌體到一個(gè)無菌Eppendorf管中，離心沉淀細(xì)胞，用微量移液器吸去LiAC。加 入下列轉(zhuǎn)化混合物：2409L 50％PEG，361aL LiAC，101aL 10rag／mE ssDNA(臨用 前應(yīng)在沸水中煮5分鐘，然后立即置于冰上以變性ssDNA)，10此轉(zhuǎn)化DNA(轉(zhuǎn) 化質(zhì)粒DNA用量為0．5pg、重組轉(zhuǎn)化DNA包括線形化載體片段llxg和目的基因 或目的基因表達(dá)單元PCR片段，PCR片段用量為載體片段摩爾比的6倍【261)， 補(bǔ)水至總體積為360pL。30℃水浴30min，42℃水浴20rain。10，000叩m，30s離 心，用微量移液器吸去上清，加100“L無菌水涂布選擇性平板。30℃靜置培養(yǎng) 2~3天。 |
3樓2013-03-26 14:57:26
冰藝于欣然
新蟲 (小有名氣)
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4樓2014-03-29 09:23:17
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