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擴(kuò)增一個(gè)基因
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BT017850 鏈接里的這個(gè)基因是blast出來的，但是引物設(shè)計(jì)了多次了，都沒有擴(kuò)出來，不知道是怎么回事，是不是這段序列本身就是錯(cuò)誤的呢？ 求高人指點(diǎn)，小弟不勝感激。 |
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nxguojunxian
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-07-15 20:20:47
1949stone: 回帖置頂 2013-07-16 08:14:11
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序列不會(huì)是錯(cuò)誤的，可能您的序列和鏈接中的序列有些差異，但一般庫里公布的序列是沒有問題的，因此建議您從模板，引物，PCR反應(yīng)體系上找原因：1模板的質(zhì)量，最好擴(kuò)增之前跑一下模板，對模板的質(zhì)量包括濃度和純度有個(gè)大概了解。 2引物設(shè)計(jì)是否合理，包括GC含量，TM值等，一般GC含量在40-60%，TM在55-65度比較好，2個(gè)引物的TM值還不能差異太大，另外還要注意設(shè)計(jì)引物注意避開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體，堿基錯(cuò)配等。 3 PCR體系一般不會(huì)有問題，模板質(zhì)量不好多加一些，質(zhì)量好稀釋少加些。 4 退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)。 |
4樓2013-07-15 15:50:52
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