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[求助]
擴(kuò)增一個(gè)基因
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BT017850 鏈接里的這個(gè)基因是blast出來(lái)的，但是引物設(shè)計(jì)了多次了，都沒(méi)有擴(kuò)出來(lái)，不知道是怎么回事，是不是這段序列本身就是錯(cuò)誤的呢？ 求高人指點(diǎn)，小弟不勝感激。 |
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2樓2013-07-15 09:55:01
wangweida2
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3樓2013-07-15 14:28:58
nxguojunxian
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-07-15 20:20:47
1949stone: 回帖置頂 2013-07-16 08:14:11
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序列不會(huì)是錯(cuò)誤的，可能您的序列和鏈接中的序列有些差異，但一般庫(kù)里公布的序列是沒(méi)有問(wèn)題的，因此建議您從模板，引物，PCR反應(yīng)體系上找原因：1模板的質(zhì)量，最好擴(kuò)增之前跑一下模板，對(duì)模板的質(zhì)量包括濃度和純度有個(gè)大概了解。 2引物設(shè)計(jì)是否合理，包括GC含量，TM值等，一般GC含量在40-60%，TM在55-65度比較好，2個(gè)引物的TM值還不能差異太大，另外還要注意設(shè)計(jì)引物注意避開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體，堿基錯(cuò)配等。 3 PCR體系一般不會(huì)有問(wèn)題，模板質(zhì)量不好多加一些，質(zhì)量好稀釋少加些。 4 退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)。 |
4樓2013-07-15 15:50:52
1949stone: 建議檢測(cè)模板質(zhì)量 可以選擇一段不是目的基因 擴(kuò)增嘗試下 再一可以找一些近緣物種基因片段校正你的引物 2013-07-16 08:15:43
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首先，我的模版應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)榱�、可以擴(kuò)增出其他基因，引物也是設(shè)計(jì)了多次，prime5顯示質(zhì)量很好，而且也讓其他老師看過(guò)，都說(shuō)引物可以，酶也沒(méi)有問(wèn)題，擴(kuò)其他基因很好用，因此我才說(shuō)是不是有可能是數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列有問(wèn)題呢。唉，愁人 |
5樓2013-07-15 16:44:31
1949stone: 數(shù)據(jù)庫(kù)里的基因一般不會(huì)有問(wèn)題 這可是發(fā)表文章里引用的 你可以給作者郵件 溝通一下 2013-07-16 08:16:42
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首先，我的模版應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)榱�、可以擴(kuò)增出其他基因，引物也是設(shè)計(jì)了多次，prime5顯示質(zhì)量很好，而且也讓其他老師看過(guò)，都說(shuō)引物可以，pcr退火溫度也是反復(fù)試了好多次，都沒(méi)有結(jié)果。酶也沒(méi)有問(wèn)題，擴(kuò)其他基因很好用，因此我才說(shuō)是不是有可能是數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列有問(wèn)題呢。 |
6樓2013-07-15 16:46:23
wangweida2
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7樓2013-07-15 17:19:22
8樓2013-07-15 17:32:52
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9樓2013-07-15 22:06:04
10樓2013-07-16 00:37:21
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