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514278815木蟲 (小有名氣)
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[求助]
原核表達(dá)蛋白復(fù)性的具體方案
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原核表達(dá)復(fù)性做了一個(gè)月了，純出來的量很少，希望蟲友們給點(diǎn)建議吧，最好有詳細(xì)的步驟； 由于需要的蛋白量較大，我才用的是柱復(fù)性；包涵體超聲破碎后，用洗滌液洗好后重溶到含8M尿素的緩沖液中；復(fù)性采用梯度復(fù)性8M-2M的梯度在superdex-75上復(fù)性；復(fù)性后進(jìn)行透析，透析時(shí)出現(xiàn)沉淀，開始懷疑透析梯度大過快了，就采用柱上緩慢換液，發(fā)現(xiàn)換液效果不好，真正到達(dá)目的緩沖液的蛋白很少；懷疑蛋白在柱子上析出來了。希望蟲友給些建議吧，目前懷疑蛋白復(fù)性效果不佳，希望能給一個(gè)合理的柱上復(fù)性方案 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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9樓2013-11-04 12:21:31
shenlin0514
木蟲 (正式寫手)
無名小蟲
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-11-01 11:35:41
514278815: 金幣+55 2013-11-01 19:52:18
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514278815: 金幣+55 2013-11-01 19:52:18
| 建議你再分析一下該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是否存在大量的疏水區(qū)域，有時(shí)添加Tag可以幫助其復(fù)性。另外，可以考慮表面活性劑的使用。 |
2樓2013-11-01 10:33:59
514278815
木蟲 (小有名氣)
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3樓2013-11-01 19:55:16
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4樓2013-11-02 16:40:32
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