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zpsl1986新蟲 (初入文壇)
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[求助]
雙酶切轉(zhuǎn)化之后不長菌
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| 求助大家，我構(gòu)建載體，用的BamHI 和XbaI雙酶切，載體大小10000bp，基因大小1000bp，酶切連接之后轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化幾次都不長菌，做的對照正常，說明轉(zhuǎn)化沒有問題，平板的抗性也沒問題，看網(wǎng)上說XbaI受甲基化影響，我用的是top10的大腸桿菌感受態(tài)，不知道跟甲基化有什么關(guān)系。希望大家給分析一下！不勝感激！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-11-07 16:41:46
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-11-07 16:41:46
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我最近正好剛剛用這兩個酶做雙酶切連接構(gòu)建，一切很順利，幾乎都是陽性克隆。 我用的是酶是NEB的。lz說的比較含糊，這個是常規(guī)技術(shù)，雙酶切連接理論上成功率是相當高的。沒有太多可說的，2個建議僅供參考： 1. 酶切問題，你是怎么得到酶切處理后的片段和載體的呢？如何確保你得到酶切處理成功了呢？雙酶切的緩沖液是否正確呢？ 2.連接問題，你是如何做的連接反應(yīng)呢？是否可改進？比如4度過夜，或者16度超過4小時？ |
4樓2013-11-07 09:40:32
★ ★
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2樓2013-11-04 11:32:01
zpsl1986
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3樓2013-11-04 15:27:57
shanqian1988
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