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楊玉煥123木蟲 (小有名氣)
陽光
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[求助]
載體去磷酸化后的回收問題 已有5人參與
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本人用的是單酶切，自連現(xiàn)象很嚴(yán)重，需要去磷酸化，選用的是CIAP，按照說明50度反應(yīng)30分鐘后采用以下2種方法： 1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收 2、65度反應(yīng)30分鐘使酶失活，然后用等體積的酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提一次，之后加入1/20倍體積5M的氯化鈉和2倍體積的無水乙醇（加乙醇的時(shí)候明顯能看到絮狀產(chǎn)生），-20℃沉淀1h，13000rpm離心2min后棄上清，然后用70%的乙醇洗滌一遍，吹干后加10微升無菌去離子水溶解 各 取2微升1、2所得溶液進(jìn)行電泳檢測，1能看到DNA條帶，2沒有，對二者分別進(jìn)行載體的連接反應(yīng)（實(shí)驗(yàn)組：載體、片段、T4連接酶、T4buffer，對照組：載體、T4連接酶、T4buffer）、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為方法1的實(shí)驗(yàn)組和對照組上克隆子數(shù)目都很多，挑取實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行質(zhì)�？斐榘l(fā)現(xiàn)都是載體自連產(chǎn)生的克隆。。。。方法2的實(shí)驗(yàn)組和對照組均沒有克隆子生長。。。 后來又做過幾次方法2 ，發(fā)現(xiàn)方法2的去磷酸化效果挺好的，對照有10個(gè)左右克隆子，實(shí)驗(yàn)組片段與載體也連上了，但是由于每次去磷酸化之后載體回收后電泳都檢測不到，濃度相當(dāng)?shù)牡�。。。，沒法獲得足夠多的克隆子（我需要的是建立基因組文庫，克隆子數(shù)目很大）。目前，正在嘗試延長磷酸化反應(yīng)時(shí)間，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，請問各位大俠對于方法2的DNA回收有沒什么好的建議？我看到有的文獻(xiàn)是加入1/10體積的3M醋酸鈉，pH為5.2，這又是為什么呢？加鹽的目的不就是為了中和電荷使DNA更容易沉淀么？跟所加鹽溶液的pH沒有太大的關(guān)系吧？？求指教 |
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楊玉煥123
木蟲 (小有名氣)
陽光
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5樓2014-01-17 14:46:55
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一般乙醇沉淀的效率會非常高的，基本都在90%以上啊。和你們的區(qū)別就是我們用的是5.2的醋酸鈉，然后我們離心是10分鐘。要不你延長離心時(shí)間，都能看見絮狀沉淀了。 你要是實(shí)在不行就換膠回收試劑盒啊。國產(chǎn)天跟阿之類的都特別好用。 ps你們用的啥ciap，竟然反應(yīng)溫度為50度啊 |
2樓2014-01-17 00:32:20
楊玉煥123
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3樓2014-01-17 10:54:17
4樓2014-01-17 11:08:22
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