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楊玉煥123木蟲 (小有名氣)
陽光
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[求助]
載體去磷酸化后的回收問題 已有5人參與
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本人用的是單酶切，自連現(xiàn)象很嚴(yán)重，需要去磷酸化，選用的是CIAP，按照說明50度反應(yīng)30分鐘后采用以下2種方法： 1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收 2、65度反應(yīng)30分鐘使酶失活，然后用等體積的酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提一次，之后加入1/20倍體積5M的氯化鈉和2倍體積的無水乙醇（加乙醇的時候明顯能看到絮狀產(chǎn)生），-20℃沉淀1h，13000rpm離心2min后棄上清，然后用70%的乙醇洗滌一遍，吹干后加10微升無菌去離子水溶解 各 取2微升1、2所得溶液進(jìn)行電泳檢測，1能看到DNA條帶，2沒有，對二者分別進(jìn)行載體的連接反應(yīng)（實(shí)驗(yàn)組：載體、片段、T4連接酶、T4buffer，對照組：載體、T4連接酶、T4buffer）、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為方法1的實(shí)驗(yàn)組和對照組上克隆子數(shù)目都很多，挑取實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行質(zhì)�？斐榘l(fā)現(xiàn)都是載體自連產(chǎn)生的克隆。。。。方法2的實(shí)驗(yàn)組和對照組均沒有克隆子生長。。。 后來又做過幾次方法2 ，發(fā)現(xiàn)方法2的去磷酸化效果挺好的，對照有10個左右克隆子，實(shí)驗(yàn)組片段與載體也連上了，但是由于每次去磷酸化之后載體回收后電泳都檢測不到，濃度相當(dāng)?shù)牡汀�。。，沒法獲得足夠多的克隆子（我需要的是建立基因組文庫，克隆子數(shù)目很大）。目前，正在嘗試延長磷酸化反應(yīng)時間，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，請問各位大俠對于方法2的DNA回收有沒什么好的建議？我看到有的文獻(xiàn)是加入1/10體積的3M醋酸鈉，pH為5.2，這又是為什么呢？加鹽的目的不就是為了中和電荷使DNA更容易沉淀么？跟所加鹽溶液的pH沒有太大的關(guān)系吧？？求指教 |
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楊玉煥123: 回帖置頂 2014-02-25 11:52:33
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-02-25 13:01:59
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會不會是試劑不純？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步驟寫出來吧： 1、加入1/20倍體積5M的氯化鈉，加入1/10電泳buffer（主要為了帶藍(lán)色好看清分層）。 2、加入等體積氯仿充分混勻，12000rpm 3min，保留上清。 3、加入2倍體積乙醇，充分混勻，12000rpm 10min，小心吸走上清。 4、加入適量75%乙醇，12000rpm 2min，小心吸走上清，用10uL槍頭在不碰到沉淀的前提下盡量吸走乙醇。 5、室溫晾干，或者放37度培養(yǎng)箱中晾干，或者放真空泵中抽干。 6、加雙蒸水溶解。 和回收率相關(guān)的關(guān)鍵步驟是第2步上清的保留量和第3步離心時間。然后就是注意小心不要搞丟了DNA沉淀了. 要找原因的話，建議各個步驟都取一點(diǎn)液體出來跑膠看看DNA的量。 |
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楊玉煥12314樓2014-02-24 22:21:54
【答案】應(yīng)助回帖
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楊玉煥123: 金幣+16, ★有幫助 2014-03-04 10:36:24
楊玉煥123: 金幣+16, ★有幫助 2014-03-04 10:36:24
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哦，寫錯了，是氯仿異戊醇。沒用過酚。 我在200 uL PCR管里操作，加幾十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL離心管再套到1.5 mL離心管里再去離心。 你這是要做載體單酶切去磷酸化嗎？有些限制酶的buffer和CIP是兼容的，譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶，20uL 體系37度酶切反應(yīng)半小時后，直接加Takara的cip 0.5～1 uL，繼續(xù)37度反應(yīng)1小時，高溫失活，跑膠回收。這樣就省下一個回收步驟了。 |
21樓2014-03-04 10:22:52
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2014-01-17 12:47:09
楊玉煥123: 金幣+10, ★有幫助 2014-01-17 14:47:14
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楊玉煥123: 金幣+10, ★有幫助 2014-01-17 14:47:14
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一般乙醇沉淀的效率會非常高的，基本都在90%以上啊。和你們的區(qū)別就是我們用的是5.2的醋酸鈉，然后我們離心是10分鐘。要不你延長離心時間，都能看見絮狀沉淀了。 你要是實(shí)在不行就換膠回收試劑盒啊。國產(chǎn)天跟阿之類的都特別好用。 ps你們用的啥ciap，竟然反應(yīng)溫度為50度啊 |
2樓2014-01-17 00:32:20
楊玉煥123
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3樓2014-01-17 10:54:17
4樓2014-01-17 11:08:22
楊玉煥123
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5樓2014-01-17 14:46:55
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7樓2014-02-19 19:54:39
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楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵交流 2014-02-20 08:27:00
楊玉煥123: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-02-24 21:15:44
楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵交流 2014-02-20 08:27:00
楊玉煥123: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-02-24 21:15:44
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對于2我想說幾點(diǎn)，畢竟我回收小RNA都成功了，還是PAGE回收，所以我有發(fā)言權(quán)，金幣多多的給。 （1）我沒有見過加Nacl進(jìn)行促沉的，這種鹽離子也很難去除，但是加醋酸鈉時可以的，畢竟這個是弱酸強(qiáng)堿鹽類，具有一定的緩沖性能。（2）-20度促沉也是對的，但是你的離心時間是否非常短，我做一般的都10min，做小RNA得高速離心半小時，你才2分鐘。（3）利用酚仿抽提也會損失20-40%。（4）最后你又洗了一遍也會損失一點(diǎn)。所以綜合因素2不見產(chǎn)物不足為怪。 |
9樓2014-02-19 22:43:04
10樓2014-02-24 10:38:54
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