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楊玉煥123木蟲 (小有名氣)
陽光
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[求助]
載體去磷酸化后的回收問題 已有5人參與
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本人用的是單酶切，自連現(xiàn)象很嚴重，需要去磷酸化，選用的是CIAP，按照說明50度反應30分鐘后采用以下2種方法： 1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收 2、65度反應30分鐘使酶失活，然后用等體積的酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提一次，之后加入1/20倍體積5M的氯化鈉和2倍體積的無水乙醇（加乙醇的時候明顯能看到絮狀產(chǎn)生），-20℃沉淀1h，13000rpm離心2min后棄上清，然后用70%的乙醇洗滌一遍，吹干后加10微升無菌去離子水溶解 各 取2微升1、2所得溶液進行電泳檢測，1能看到DNA條帶，2沒有，對二者分別進行載體的連接反應（實驗組：載體、片段、T4連接酶、T4buffer，對照組：載體、T4連接酶、T4buffer）、轉(zhuǎn)化實驗，結(jié)果為方法1的實驗組和對照組上克隆子數(shù)目都很多，挑取實驗組進行質(zhì)�？斐榘l(fā)現(xiàn)都是載體自連產(chǎn)生的克隆。。。。方法2的實驗組和對照組均沒有克隆子生長。。。 后來又做過幾次方法2 ，發(fā)現(xiàn)方法2的去磷酸化效果挺好的，對照有10個左右克隆子，實驗組片段與載體也連上了，但是由于每次去磷酸化之后載體回收后電泳都檢測不到，濃度相當?shù)牡�。。。，沒法獲得足夠多的克隆子（我需要的是建立基因組文庫，克隆子數(shù)目很大）。目前，正在嘗試延長磷酸化反應時間，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，請問各位大俠對于方法2的DNA回收有沒什么好的建議？我看到有的文獻是加入1/10體積的3M醋酸鈉，pH為5.2，這又是為什么呢？加鹽的目的不就是為了中和電荷使DNA更容易沉淀么？跟所加鹽溶液的pH沒有太大的關(guān)系吧？？求指教 |
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forrestgump
新蟲 (著名寫手)
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【答案】應助回帖
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楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵交流 2014-02-20 08:27:00
楊玉煥123: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-02-24 21:15:44
楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵交流 2014-02-20 08:27:00
楊玉煥123: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-02-24 21:15:44
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對于2我想說幾點，畢竟我回收小RNA都成功了，還是PAGE回收，所以我有發(fā)言權(quán)，金幣多多的給。 （1）我沒有見過加Nacl進行促沉的，這種鹽離子也很難去除，但是加醋酸鈉時可以的，畢竟這個是弱酸強堿鹽類，具有一定的緩沖性能。（2）-20度促沉也是對的，但是你的離心時間是否非常短，我做一般的都10min，做小RNA得高速離心半小時，你才2分鐘。（3）利用酚仿抽提也會損失20-40%。（4）最后你又洗了一遍也會損失一點。所以綜合因素2不見產(chǎn)物不足為怪。 |
9樓2014-02-19 22:43:04
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2014-01-17 12:47:09
楊玉煥123: 金幣+10, ★有幫助 2014-01-17 14:47:14
感謝參與，應助指數(shù) +1
楊玉煥123(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2014-01-17 12:47:09
楊玉煥123: 金幣+10, ★有幫助 2014-01-17 14:47:14
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一般乙醇沉淀的效率會非常高的，基本都在90%以上啊。和你們的區(qū)別就是我們用的是5.2的醋酸鈉，然后我們離心是10分鐘。要不你延長離心時間，都能看見絮狀沉淀了。 你要是實在不行就換膠回收試劑盒啊。國產(chǎn)天跟阿之類的都特別好用。 ps你們用的啥ciap，竟然反應溫度為50度啊 |
2樓2014-01-17 00:32:20
楊玉煥123
木蟲 (小有名氣)
陽光
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4樓2014-01-17 11:08:22
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