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[求助]
pet32a雙酶切之后，電泳條帶找不到 已有3人參與
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小弟本科生一枚，最近在構(gòu)建一種菌，可是經(jīng)過了兩個(gè)月的嘗試，還是沒有成功，愁死了，這個(gè)是學(xué)校的一個(gè)大學(xué)生訓(xùn)練項(xiàng)目，搞了這么久還沒構(gòu)建出菌種，我在九月之前還要做出目的蛋白的表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白的性質(zhì)做出研究，才能結(jié)題，現(xiàn)在是愁死了，求告各位大俠給予意見。 首先，我用的是X-hol和BamHI這兩個(gè)酶，目的基因在2700左右，目的基因在經(jīng)過PCR之后，做37度雙酶切6h能跑出目的條帶。這個(gè)是確定的。但是在雙酶切32a質(zhì)粒之后，確實(shí)無論如何也跑不出條帶。后來又做了單酶切切pet-32a質(zhì)粒，但是3h之后，依舊是沒有任何條帶出現(xiàn)。（聲明：32a未經(jīng)酶切的質(zhì)粒是跑得出來的。）今日又做了分小時(shí)單酶切，做法是每半小時(shí)去一次37度酶切樣品，迅速放入65度烘箱中使其中的酶失活，共切了兩個(gè)小時(shí)，卻還是沒有跑出任何條帶，這不應(yīng)該啊，剛加入酶就取樣的也沒跑出來，這太不合理了吧！（取樣：2微升跑膠。）今天的除了沒有酶切過的質(zhì)粒跑出來了非常明顯的條帶，其余的都沒跑出來，是跑膠打樣太少了么？ 雙酶切體系：50微升 10Xbuffer tango 10微升 BamHi 2微升 X-hol 2微升 pet-32a質(zhì)粒 36微升（有時(shí)質(zhì)粒濃度高的話也會(huì)用25微升質(zhì)粒加11微升ddH2O） 37度水浴6h 單酶切體系：20微升 buffer tango 4微升 BamHI 0.5微升 32a質(zhì)粒 10微升 ddH2O 5.5微升 單酶切體系：20微升 buffer tango 4微升 X-hol 0.5微升 32a質(zhì)粒 10微升 ddH2O 5.5微升 另外，跑膠電壓是100V 時(shí)間是40分鐘 這個(gè)應(yīng)該不會(huì)有什么問題吧？ |
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yixinyuan
木蟲 (正式寫手)
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6樓2014-03-07 22:40:56
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