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PCR 克隆 問題，小弟新手，求幫助。 已有3人參與
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最近很不順利，不知到底是哪兒出現(xiàn)了問題。 目的片段，1800-—2500bp 中間含有太多重復(fù)序列。 載體：PMD19-T 第一點、PCR擴增 ， 電泳回收 (試劑盒回收并電泳檢測） 連接：DNA:7.7 BUFFER:1 T4酶：1 pmd19-T：0.3 過夜16H左右。 轉(zhuǎn)化：感受態(tài)是自己做的，涂板過夜培養(yǎng)一般長的很好，不知道是否代表感受態(tài)沒有問題？ PCR陽性鑒定：r-taq酶，最近一直沒有結(jié)果。 第二點、將PCR鑒定有陽性的用來提取質(zhì)粒，做亞克隆，因為重復(fù)序列多，2000bp+的一般不容易測通。 雙酶切之后電泳回收，條帶明顯存在梯度，是否代表這一步成功了。 然后，再一次連接 DNA:8 T4酶：1 BUFFER:1 過夜16度 16H 轉(zhuǎn)化也能長得很好，感受態(tài)還是用自己做的，但是陽性仍然沒有。 途中曾經(jīng)將未檢測到陽性的 送到公司測序，顯示空載。 所以我想是不是連接沒有連接上？還是感受態(tài)問題？還是實驗室藥品有問題（大家陽性檢測也很少很少，但我沒有）？還是我以上步驟存在問題？特別是第二點亞克隆是否存在問題？ |
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