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[求助]
PCR 克隆 問(wèn)題，小弟新手，求幫助。 已有3人參與
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最近很不順利，不知到底是哪兒出現(xiàn)了問(wèn)題。 目的片段，1800-—2500bp 中間含有太多重復(fù)序列。 載體：PMD19-T 第一點(diǎn)、PCR擴(kuò)增 ， 電泳回收 (試劑盒回收并電泳檢測(cè)） 連接：DNA:7.7 BUFFER:1 T4酶：1 pmd19-T：0.3 過(guò)夜16H左右。 轉(zhuǎn)化：感受態(tài)是自己做的，涂板過(guò)夜培養(yǎng)一般長(zhǎng)的很好，不知道是否代表感受態(tài)沒(méi)有問(wèn)題？ PCR陽(yáng)性鑒定：r-taq酶，最近一直沒(méi)有結(jié)果。 第二點(diǎn)、將PCR鑒定有陽(yáng)性的用來(lái)提取質(zhì)粒，做亞克隆，因?yàn)橹貜?fù)序列多，2000bp+的一般不容易測(cè)通。 雙酶切之后電泳回收，條帶明顯存在梯度，是否代表這一步成功了。 然后，再一次連接 DNA:8 T4酶：1 BUFFER:1 過(guò)夜16度 16H 轉(zhuǎn)化也能長(zhǎng)得很好，感受態(tài)還是用自己做的，但是陽(yáng)性仍然沒(méi)有。 途中曾經(jīng)將未檢測(cè)到陽(yáng)性的 送到公司測(cè)序，顯示空載。 所以我想是不是連接沒(méi)有連接上？還是感受態(tài)問(wèn)題？還是實(shí)驗(yàn)室藥品有問(wèn)題（大家陽(yáng)性檢測(cè)也很少很少，但我沒(méi)有）？還是我以上步驟存在問(wèn)題？特別是第二點(diǎn)亞克隆是否存在問(wèn)題？ |
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4樓2014-04-23 01:10:24
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2樓2014-04-22 19:49:51
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【答案】應(yīng)助回帖
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zlimba(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-04-23 12:06:15
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電泳回收后要再跑個(gè)電泳看下條帶亮度，確定回收成功，可以的話還可以測(cè)濃度，如果很亮，或者濃度高，連接的時(shí)候DNA就沒(méi)必要加太多，可能2-3就可以，載體0.3有點(diǎn)少，10的體系，應(yīng)該加1。 PCR陽(yáng)性檢測(cè)時(shí)，假陽(yáng)性太高，退火溫度要很高來(lái)減少假陽(yáng)性才行，可以只比引物TM值低1-2度，提完質(zhì)粒做酶切鑒定更可靠。送測(cè)序就OK了，一次成功，不用二次連接的。 |
3樓2014-04-23 01:08:00
5樓2014-04-23 10:35:43
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