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summermio新蟲 (初入文壇)
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同源重組陽性單菌落問題 已有2人參與
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最近在做同源重組， 想把一個(gè)熒光蛋白的基因整合到大腸桿菌基因組的某個(gè)地方里， 用的是 red recombinase. 好不容易篩選到幾個(gè)陽性菌落后做菌落PCR， 引物選用construct上下游的各一段基因，可是每個(gè)單菌落pcr出來都有兩條帶， 一條大小2kb，恰好是整合進(jìn)去的結(jié)果，一條是300bp（類似WT的結(jié)果）， 是沒整合進(jìn)去的意思。 我以為是單菌落不純， 于是用驗(yàn)證過的陽性單菌落再涂reduction plate， 再挑單菌落pcr得出來的結(jié)果還是混合2kb條帶和300bp條帶的結(jié)果，為啥一個(gè)單菌落里會(huì)有兩種基因型呢？？？？各位大俠有什么解釋和辦法么，，，好不容易有一個(gè)結(jié)果~~~(>_< ~~~ |
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4樓2014-04-30 21:03:37
【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-04-30 10:41:25
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-04-30 10:41:25
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嗯，是不是基因組里其他地方有類似的序列呢？染色體重組做的少，不過有篇不錯(cuò)的文章，不知道你看了沒有 One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner 2000 PNAS vol 97 6640–6645 |
2樓2014-04-30 05:32:16
summermio
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必須看了呀。基本就是按著這個(gè)做的。3樓2014-04-30 18:52:59
summermio
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5樓2014-04-30 21:36:32
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