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博克儂浮碼銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
載體是否自連 已有2人參與
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最近在做克隆，但是出現(xiàn)了好多問題，請(qǐng)教各位前輩，給予幫助，不勝感激��！ 1.引物-F-CAGT---------------------TTGT R-ATCC---------------------AATG 這對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物是否與PGEM-Teasy 載體連接 2.用上述引物擴(kuò)增的目的片段與T載體連接后挑白斑，擴(kuò)PCR后條帶非常亮，但是所提取的質(zhì)粒片段大于目的基因與載體連在一起的片段，單酶切也沒有出現(xiàn)目的條帶 |
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gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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1. 引物的擴(kuò)增產(chǎn)物是否與PGEM-Teasy 載體連接 如果你用的是Taq酶擴(kuò)增出來的，可以直接和pGEM T-easy，如果是高保真酶擴(kuò)增出來的，需要先加A后，再和pGEM T-GEM連接 2. 擴(kuò)PCR后條帶非常亮 你是用什么引物做菌落PCR的，如何來排除假陽性的 3. 但是所提取的質(zhì)粒片段大于目的基因與載體連在一起的片段，單酶切也沒有出現(xiàn)目的條帶 因?yàn)槟愕妮d體沒有線性化，所以不好從大小上進(jìn)行判斷，單酶切也沒有出現(xiàn)目的條帶可能是因?yàn)槟爿d體上只有一個(gè)這個(gè)位點(diǎn) |
3樓2014-07-16 10:56:40
ltfe567
木蟲 (正式寫手)
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2樓2014-07-04 10:18:58
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