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胡琴HuQin新蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于重組質(zhì)粒 已有3人參與
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最近實(shí)驗(yàn)遇到了瓶頸，小女子希望能在此得到各位大俠的指點(diǎn)！ 我最近在做熒光定量RT-PCR方法的建立，需要以RNA為模版建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。過程大致為：將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pGEM-T載體上,構(gòu)建pGEM-T/A2重組質(zhì)粒,并進(jìn)行測序鑒定。然后對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄生成的RNA經(jīng)過DNasel處理后作為定量用標(biāo)準(zhǔn)品。因?yàn)樾枰w外轉(zhuǎn)錄成RNA，所以重組質(zhì)粒鏈接的片段需要是反向鏈接的才行，但是已經(jīng)送6分重組質(zhì)粒去測序了，全都是正向鏈接的！再這樣測下去，什么時(shí)候是個(gè)頭啊  ？請(qǐng)問各位高手，有木有什么辦法改善一下這個(gè)情況呢？謝謝大家了~ |
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gyesang
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5樓2014-07-22 16:31:31
2樓2014-07-20 20:29:07
gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-21 08:29:23
胡琴HuQin: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-07-22 15:51:09
kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-21 08:29:23
胡琴HuQin: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-07-22 15:51:09
| 不就你帖子里面的其他內(nèi)容提出過多的疑問，單就片段連pGEM-T后的方向問題，如果你想獲得另外一個(gè)方向的重組質(zhì)粒，你得把擴(kuò)增產(chǎn)物重新連接到pGEM-T上，據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，理論上片段連T載體后，兩個(gè)方向的概率各50%，而實(shí)際上在一次實(shí)驗(yàn)的連接體系里面，大部分方向是一致的（一個(gè)板子上長出的克隆發(fā)現(xiàn)基本一致，個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，所以你不用再在同一個(gè)板子上挑克隆測序了），要想獲得另外一個(gè)方向的，必須再做一次獨(dú)立的連接和轉(zhuǎn)化，然后看看是不是另外一個(gè)方向的（這也需要一定的運(yùn)氣） |
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胡琴HuQin3樓2014-07-20 20:38:40
胡琴HuQin
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4樓2014-07-22 15:50:41
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