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為什么用cDNA做模板的PCR感覺(jué)很不穩(wěn)定啊 已有2人參與
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最近在拉一個(gè)基因的CDs部分，不知道是什么原因，用梯度PCR優(yōu)化退火溫度，根據(jù)梯度PCR結(jié)果設(shè)定的溫度，就木有帶的情況。兩次所用的PCR條件是完全一致的。 我這是用oligo(dT) 引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板，換了好多引物都出現(xiàn)類似的結(jié)果。 基因的GC搞會(huì)不會(huì)出現(xiàn)這樣的情況？ 還是說(shuō)是模板的原因？ 總共就1kb多的基因CDs，擴(kuò)不出來(lái)真是說(shuō)不過(guò)去啊。 哪位有經(jīng)驗(yàn)的還望指點(diǎn)一下 gel.jpg |
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wei8020
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有可能是pcr儀不穩(wěn)定，或者標(biāo)稱溫度不準(zhǔn)確，解決辦法就是還跑同樣的梯度程序，把你的樣品放在對(duì)應(yīng)的那一行孔里面，這樣能保證條件一致。 另一方面，你確定這個(gè)基因在你提RNA的組織中表達(dá)量高嗎？嘗試換個(gè)表達(dá)量高的組織提RNA，會(huì)擴(kuò)的好些。 |
2樓2014-07-24 20:31:50
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泰州木蟲(chóng): 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-07-25 09:29:31
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假定你要的產(chǎn)物的確有表達(dá)，而且你的cDNA也沒(méi)問(wèn)題的話，那么考慮GC含量是一個(gè)方面。GC高的話第一是不容易擴(kuò)增，第二還有可能缺失片斷。如果你的聚合酶有GC enhancer的話可以加一些試一下，會(huì)有幫助的。我曾經(jīng)有克隆過(guò)一個(gè)總長(zhǎng)1.5k的片段，其中有一段GC%有百分之八九十，就很容易擴(kuò)增失敗或者是缺失序列。加了GC enhancer就好了。 其次就是你的酶，如果你的序列GC含量高的話，那么普通的酶是很難擴(kuò)出來(lái)東西的。最好用好一些的，我個(gè)人最喜歡用的是Invitrogen的Pfx，剛才說(shuō)的那個(gè)問(wèn)題就是用Pfx+GC enhancer解決的。而且我后來(lái)用普通Taq酶作菌液PCR的時(shí)候就很難得到目的片段，也是由于普通Taq酶不給力的問(wèn)題。再次說(shuō)明酶是個(gè)比較重要的因素，尤其GC高的時(shí)候。 再次就是PCR反應(yīng)了。說(shuō)實(shí)話66度感覺(jué)挺高的，一般我很少會(huì)用到這么高溫，不過(guò)當(dāng)然也可能跟你設(shè)計(jì)引物有關(guān)�？梢栽囍鰝�(gè)梯度還有就是延伸時(shí)間注意要夠長(zhǎng)。 暫時(shí)想到這么多吧。 |
3樓2014-07-24 20:43:09
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5樓2014-07-25 09:34:03
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GC含量高的情況，我也遇到過(guò)，對(duì)于這種高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,當(dāng)然現(xiàn)在也有專門(mén)這種PCR Buffer。LZ可以搜搜看Genloci牌的。 幾點(diǎn)建議： 先優(yōu)化反應(yīng)條件，GC豐富的序列，退火溫度其實(shí)也不用刻意加高 主要是變性溫度，預(yù)變性96度5分鐘然后再加酶（熱啟動(dòng)） 一般循環(huán)的變性溫度用95度比94好，還不行還可以再加高 還有DMSO和甘油，各加到5％就足夠了，光加DMSO有的時(shí)候會(huì)使酶的半衰期下降 |
8樓2014-07-25 12:31:15
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