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泰州木蟲金蟲 (小有名氣)
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[求助]
為什么用cDNA做模板的PCR感覺很不穩(wěn)定啊 已有2人參與
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最近在拉一個基因的CDs部分，不知道是什么原因，用梯度PCR優(yōu)化退火溫度，根據(jù)梯度PCR結(jié)果設(shè)定的溫度，就木有帶的情況。兩次所用的PCR條件是完全一致的。 我這是用oligo(dT) 引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板，換了好多引物都出現(xiàn)類似的結(jié)果。 基因的GC搞會不會出現(xiàn)這樣的情況？ 還是說是模板的原因？ 總共就1kb多的基因CDs，擴不出來真是說不過去啊。 哪位有經(jīng)驗的還望指點一下 gel.jpg |
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泰州木蟲
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5樓2014-07-25 09:34:03
wei8020
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有可能是pcr儀不穩(wěn)定，或者標(biāo)稱溫度不準(zhǔn)確，解決辦法就是還跑同樣的梯度程序，把你的樣品放在對應(yīng)的那一行孔里面，這樣能保證條件一致。 另一方面，你確定這個基因在你提RNA的組織中表達(dá)量高嗎？嘗試換個表達(dá)量高的組織提RNA，會擴的好些。 |
2樓2014-07-24 20:31:50
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假定你要的產(chǎn)物的確有表達(dá)，而且你的cDNA也沒問題的話，那么考慮GC含量是一個方面。GC高的話第一是不容易擴增，第二還有可能缺失片斷。如果你的聚合酶有GC enhancer的話可以加一些試一下，會有幫助的。我曾經(jīng)有克隆過一個總長1.5k的片段，其中有一段GC%有百分之八九十，就很容易擴增失敗或者是缺失序列。加了GC enhancer就好了。 其次就是你的酶，如果你的序列GC含量高的話，那么普通的酶是很難擴出來東西的。最好用好一些的，我個人最喜歡用的是Invitrogen的Pfx，剛才說的那個問題就是用Pfx+GC enhancer解決的。而且我后來用普通Taq酶作菌液PCR的時候就很難得到目的片段，也是由于普通Taq酶不給力的問題。再次說明酶是個比較重要的因素，尤其GC高的時候。 再次就是PCR反應(yīng)了。說實話66度感覺挺高的，一般我很少會用到這么高溫，不過當(dāng)然也可能跟你設(shè)計引物有關(guān)�？梢栽囍鰝�梯度還有就是延伸時間注意要夠長。 暫時想到這么多吧。 |
3樓2014-07-24 20:43:09
泰州木蟲
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4樓2014-07-25 09:29:34
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