 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5863 | 回復(fù): 8 | ||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||
泰州木蟲金蟲 (小有名氣)
|
[求助]
為什么用cDNA做模板的PCR感覺很不穩(wěn)定啊 已有2人參與
|
|
|
最近在拉一個基因的CDs部分，不知道是什么原因，用梯度PCR優(yōu)化退火溫度，根據(jù)梯度PCR結(jié)果設(shè)定的溫度，就木有帶的情況。兩次所用的PCR條件是完全一致的。 我這是用oligo(dT) 引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板，換了好多引物都出現(xiàn)類似的結(jié)果。 基因的GC搞會不會出現(xiàn)這樣的情況？ 還是說是模板的原因？ 總共就1kb多的基因CDs，擴(kuò)不出來真是說不過去啊。 哪位有經(jīng)驗的還望指點(diǎn)一下 gel.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗中的趣事：實(shí)驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗中的趣事：和實(shí)驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有180人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗之小鼠實(shí)驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 長距離PCR擴(kuò)增ds cDNA用什么引物
已經(jīng)有3人回復(fù)
- PCR條帶彌散，不知道是什么原因，希望各位師兄師姐幫我看看。
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 以cDNA為模板擴(kuò)增的目的基因發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子？
已經(jīng)有1人回復(fù)
- PCR條件不可重復(fù)
已經(jīng)有25人回復(fù)
- 基因組DNA做模板擴(kuò)增目的片段比cDND擴(kuò)增得到的短
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 求幫忙分析一下關(guān)于PCR產(chǎn)物電泳圖片
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 擬南芥核基因編碼蛋白，定位于葉綠體。已知氨基酸序列，怎么找到前導(dǎo)肽？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 求助SMART RACE ，5‘-RACE問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 想在4倍體棉花里面擴(kuò)一個基因，用雷蒙德氏棉花（2倍體，已完成測序）設(shè)計引物。。
已經(jīng)有5人回復(fù)
- QPCR模板濃度一定要是200ng或以下嗎
已經(jīng)有4人回復(fù)
- PT-PCR
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 急救！cDNA做模板進(jìn)行PCR克隆出的質(zhì)粒測出了一段內(nèi)含子
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 有沒有什么好方法來挑選陽性克隆
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 已有cDNA庫為什么用RT-PCR制備northern雜交探針？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 克隆時出現(xiàn)的和目的基因相似度很高的片段是什么
已經(jīng)有2人回復(fù)
- 請問，用基因組DNA和cDNA做模板進(jìn)行PCR有什么區(qū)別呀？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- RT-PCR的cDNA不能擴(kuò)增出目的條帶，只有內(nèi)參基因能擴(kuò)增出來
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助】用cDNA的ORF序列以基因組DNA為模板 做PCR 為何P不出其對應(yīng)的基因組序列?
已經(jīng)有8人回復(fù)
- DNA 條帶 和 OD值
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 高GC含量基因片段PCR問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- [求助]高保真酶擴(kuò)不出來
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 為什么內(nèi)參可用rRNA?
已經(jīng)有1人回復(fù)
泰州木蟲
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1362.1
- 帖子: 148
- 在線: 62.3小時
- 蟲號: 1009144
- 注冊: 2010-04-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物資源學(xué)
4樓2014-07-25 09:29:34
wei8020
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 35.9
- 散金: 100
- 帖子: 25
- 在線: 15.1小時
- 蟲號: 1594607
- 注冊: 2012-02-01
- 性別: GG
- 專業(yè): 發(fā)育生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
泰州木蟲(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:11
泰州木蟲: 金幣+9, ★★★很有幫助 2014-07-25 09:34:11
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
泰州木蟲(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:11
泰州木蟲: 金幣+9, ★★★很有幫助 2014-07-25 09:34:11
|
有可能是pcr儀不穩(wěn)定，或者標(biāo)稱溫度不準(zhǔn)確，解決辦法就是還跑同樣的梯度程序，把你的樣品放在對應(yīng)的那一行孔里面，這樣能保證條件一致。 另一方面，你確定這個基因在你提RNA的組織中表達(dá)量高嗎？嘗試換個表達(dá)量高的組織提RNA，會擴(kuò)的好些。 |
2樓2014-07-24 20:31:50
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, MolEPI+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:24
泰州木蟲: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-07-25 09:29:31
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, MolEPI+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:24
泰州木蟲: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-07-25 09:29:31
|
假定你要的產(chǎn)物的確有表達(dá)，而且你的cDNA也沒問題的話，那么考慮GC含量是一個方面。GC高的話第一是不容易擴(kuò)增，第二還有可能缺失片斷。如果你的聚合酶有GC enhancer的話可以加一些試一下，會有幫助的。我曾經(jīng)有克隆過一個總長1.5k的片段，其中有一段GC%有百分之八九十，就很容易擴(kuò)增失敗或者是缺失序列。加了GC enhancer就好了。 其次就是你的酶，如果你的序列GC含量高的話，那么普通的酶是很難擴(kuò)出來東西的。最好用好一些的，我個人最喜歡用的是Invitrogen的Pfx，剛才說的那個問題就是用Pfx+GC enhancer解決的。而且我后來用普通Taq酶作菌液PCR的時候就很難得到目的片段，也是由于普通Taq酶不給力的問題。再次說明酶是個比較重要的因素，尤其GC高的時候。 再次就是PCR反應(yīng)了。說實(shí)話66度感覺挺高的，一般我很少會用到這么高溫，不過當(dāng)然也可能跟你設(shè)計引物有關(guān)。可以試著做個梯度還有就是延伸時間注意要夠長。 暫時想到這么多吧。 |
3樓2014-07-24 20:43:09
泰州木蟲
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1362.1
- 帖子: 148
- 在線: 62.3小時
- 蟲號: 1009144
- 注冊: 2010-04-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物資源學(xué)
5樓2014-07-25 09:34:03
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +4 | 超級伊昂大王 2026-03-24 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +3 | desto 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +10 | Zhao anqi 2026-03-22 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 341求調(diào)劑(一志愿湖南大學(xué)070300) +5 | 番茄頭--- 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
[考研] 一志愿211 初試270分 求調(diào)劑 +4 | 谷雨上岸 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿陜師大生物學(xué)071000，298分，求調(diào)劑 +3 | SYA！ 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 323求調(diào)劑 +6 | 洼小桶 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研]
 一志愿東華大學(xué)化學(xué)070300，求調(diào)劑
+7
|
2117205181 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 石河子大學(xué)（211、雙一流）碩博研究生長期招生公告 +3 | 李子目 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +8 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +4 | 來好運(yùn)來來來 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩 348分求調(diào)劑 +3 | 冬辭. 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 初始318分求調(diào)劑（有工作經(jīng)驗） +3 | 1911236844 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 華東師范大學(xué)-071000生物學(xué)-293分-求調(diào)劑 +3 | 研究生何瑤明 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 曼殊2266 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +9 | 何潤采123 2026-03-18 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | @taotao 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +3 | 妮妮ninicgb 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 26博士申請 +3 | 1042136743 2026-03-17 | 3/150 |
|