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swach鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
轉(zhuǎn)化有菌落，挑菌轉(zhuǎn)板擴(kuò)大培養(yǎng)之后，菌落PCR沒有條帶 已有2人參與
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| 轉(zhuǎn)化之后有單菌落，挑單菌落到另一個(gè)板子上擴(kuò)大培養(yǎng)，今天挑菌破壁之后，做菌落PCR，沒有目的條帶，全部是拖帶。轉(zhuǎn)化之后的板子上面單菌落有藍(lán)白斑出現(xiàn)，不知道問題出在哪里？轉(zhuǎn)化之后的單菌落長得很好，以為能成功的，同學(xué)最近也遇到了同樣的問題。難道是轉(zhuǎn)化之后的那些單菌落全都是氨芐失效長出來的雜菌嗎？還是其實(shí)都是空載，只是藍(lán)斑沒有篩選出來。大前天倒得板子，在工作臺里面放了兩天，昨天轉(zhuǎn)板，今天早上板子上出了轉(zhuǎn)化的菌落，還出現(xiàn)了單菌落。是氨芐失效了嗎？真的很急，希望大家給予意見！我的氨芐是七月四號配的，不會失效吧？ |
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swach
鐵蟲 (小有名氣)
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7樓2014-07-27 10:13:05
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-25 22:02:51
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你的amp配制之后是放在哪兒？如果是室溫有失效的危險(xiǎn)，如果是-20度冰箱是沒問題的，冰箱里可以放很久。至于你倒的板子，應(yīng)該是放在4度冰箱里靠譜一些。 第一次單菌落藍(lán)白斑出現(xiàn)后，可以直接就用白斑做菌落PCR的，沒有必要挑擔(dān)菌落到另一個(gè)板子上擴(kuò)大培養(yǎng)。你挑得單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)出來的菌落和你挑得是同源，不管你從擴(kuò)大培養(yǎng)的上面pcr多少個(gè)單菌落，都和pcr前面你挑的那個(gè)單菌落一樣。假使你挑出來擴(kuò)大培養(yǎng)的那個(gè)單菌落是假陽性的話，那么你后來再怎么做pcr也得不出目的條帶的。 你說‘出現(xiàn)了單菌落’是指菌落很密集，但菌落很少么？如果滿板子都是菌落，那么假陽性的可能性很大。如果你之前轉(zhuǎn)化的菌液有存在4度冰箱，可以拿出少量來再涂板，藍(lán)白斑篩選。試著減少涂板的菌液量，讓板子菌落數(shù)減少，這樣可以更容易挑擔(dān)菌落。藍(lán)白斑篩選后，直接挑一二十個(gè)做菌落pcr就好 最后就是，你的pcr用的引物可信么？是通用引物的話，可以同時(shí)挑藍(lán)斑pcr作對照。如果不是的話，優(yōu)化你的pcr方案，保證你的引物是工作正常的， |
2樓2014-07-25 20:03:47
luwei13566
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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swach(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-26 17:01:10
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swach(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-26 17:01:10
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1.氨芐在現(xiàn)在這個(gè)溫度下放兩天夠嗆啊。平板倒好了在超凈臺放半個(gè)小時(shí)凝固了平板口一封直接放4度了，怎么能在外面一直放，你配的那個(gè)氨芐是咋保存的啊，是不是分裝了放-20度？ 2.LZ你這個(gè)實(shí)驗(yàn)是怎么做的，你是在轉(zhuǎn)化后涂布在平板上，長出來的轉(zhuǎn)化子挑白斑在另一個(gè)板子上扎了個(gè)氨芐母板，之后用母版上的菌做的菌落PCR沒條帶，還拖尾？ 你現(xiàn)在的問題是，菌落PCR的可靠性，氨芐的可靠性，和藍(lán)白斑的陽性率。氨芐的可靠性最重要。 如果想徹底篩查的話，你最好先做個(gè)質(zhì)�？焯幔瓤纯茨隳赴嫔系霓D(zhuǎn)化子有沒有質(zhì)粒，如果你的轉(zhuǎn)化子連質(zhì)粒都沒有的話，氨芐重配，實(shí)驗(yàn)重來。一旦有質(zhì)粒的話，如果你連的基因本身就很大直接大小就可以判斷是否空載來，如果全是空載，那你就篩查一下第一步藍(lán)白斑篩選，按理說肯定有假陽性，但是如果全是假陽性也是很不正常的，你的藍(lán)白斑比例是多大啊？至于你的菌落PCR如果剛開始接觸的話最好陽性對照和陰性對照都加上，再重復(fù)幾次不要有大量拖帶才行. |
3樓2014-07-25 22:53:42
swach
鐵蟲 (小有名氣)
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4樓2014-07-26 13:18:50
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