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lilongping新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
PCR擴(kuò)增嚴(yán)重彌散，但是以前用同樣方法，條件和試劑都是結(jié)果非常好的 已有5人參與
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大家看看我這個(gè)PCR圖片是什么原因呢？ PCR條件是：94° 60s， 52°60s，72° 5min， 擴(kuò)增循環(huán)35圈，用的是3步PCR實(shí)驗(yàn)的。這個(gè)程序我一直在用，模板是細(xì)菌基因組。前一段時(shí)間用同樣的PCR方法，試劑，模板等等都是一樣的，擴(kuò)增出來(lái)了目的條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常好。最近，我想重復(fù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，再做一些回收回來(lái)測(cè)序用，但是，怎么重復(fù)，都是這種嚴(yán)重彌散啊，大家看看這種情況應(yīng)該怎么辦呢？ 前后用的PCR條件和試劑都是完全一樣的。 兩邊最邊上的3個(gè)泳道都是不同大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，他們是清醒可見(jiàn)的。 2014-08-14 5個(gè)12_5擴(kuò)增失敗.jpg |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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owl2010
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2樓2014-08-18 12:13:27
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5樓2014-08-18 22:34:49
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對(duì)策 凌波麗 2013年8月23日總結(jié)（第二次修訂，加上序號(hào)，使文章的層次清晰，另外修正了錯(cuò)漏之處） 2013年10月9日凌晨第三次修改補(bǔ)充。 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差或酶的專一性不夠，DNA模板量過(guò)大，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多，模板長(zhǎng)于3kb所引起。 其對(duì)策有： 1.減少酶量（一般以2單位Taq DNA聚合酶為基點(diǎn)，分梯度上下調(diào)一調(diào)，其他酶也差不多如此濃度，可以參考說(shuō)明書(shū)）；加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性或調(diào)換另一來(lái)源的專一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的專一性。 （1）改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時(shí)，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油，若此操作引起酶的濃度過(guò)高，可以適當(dāng)加雙蒸餾水稀釋。 （3）為了加強(qiáng)Taq DNA聚合酶的專一性。 的專一性，可在反應(yīng)體系中加入：1-1.5mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以增加Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。 3.適當(dāng)減少dNTP的濃度；減少dNTP的濃度一般需要與降低Mg2+濃度同方向偶聯(lián)進(jìn)行，但是不必按同樣的比例。 4.適當(dāng)降低Mg2+濃 度，可以采用梯度遞減方式，以每次0.5mol/L遞減，但是Mg2+的終濃度不要低于1.0mol/L。 5. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時(shí)間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒(méi)有重新設(shè)計(jì)引物之前，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 7.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動(dòng)PCR和巢式PCR。使用熱啟動(dòng)模式。使用熱啟動(dòng)時(shí)可以購(gòu)買(mǎi)商用的PCR熱啟動(dòng)酶，也可以用石蠟隔離模式。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購(gòu)買(mǎi)。 8. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測(cè)一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 9.以上措施都不行時(shí)，最后就只能重新設(shè)計(jì)引物，加強(qiáng)引物的專一性。 10.適當(dāng)減少DNA模板量。 11.適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，一般也就循環(huán)25次就差不多了。 12.如果樓主的PCR模板是3kb或者更大，用普通PCR效果大概不會(huì)很理想，應(yīng)該考慮使用Long-Range PCR。 樓主三次的實(shí)驗(yàn)流程和試劑一樣，但這次效果如此不好，我個(gè)人認(rèn)為：首先考慮酶的質(zhì)量、模板質(zhì)量（放久了模板也可能發(fā)生降解，尤其是反復(fù)凍融）、其他的試劑的質(zhì)量，實(shí)際操作是不是失準(zhǔn)等問(wèn)題（可能一些操作細(xì)節(jié)由于以前的成功，所以這次比較放松了，實(shí)際的操作并不標(biāo)準(zhǔn)）等。 |
6樓2014-08-19 02:14:17
hufangzhou
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7樓2014-08-19 08:21:39
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8樓2014-08-19 08:43:39
kkzzll0624
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9樓2014-08-19 08:46:41
墨硯塵加油
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10樓2015-12-08 11:29:48
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