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lilongping新蟲 (正式寫手)
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[求助]
PCR擴(kuò)增嚴(yán)重彌散，但是以前用同樣方法，條件和試劑都是結(jié)果非常好的 已有5人參與
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大家看看我這個PCR圖片是什么原因呢？ PCR條件是：94° 60s， 52°60s，72° 5min， 擴(kuò)增循環(huán)35圈，用的是3步PCR實驗的。這個程序我一直在用，模板是細(xì)菌基因組。前一段時間用同樣的PCR方法，試劑，模板等等都是一樣的，擴(kuò)增出來了目的條帶，實驗結(jié)果非常好。最近，我想重復(fù)這個實驗，再做一些回收回來測序用，但是，怎么重復(fù)，都是這種嚴(yán)重彌散啊，大家看看這種情況應(yīng)該怎么辦呢？ 前后用的PCR條件和試劑都是完全一樣的。 兩邊最邊上的3個泳道都是不同大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，他們是清醒可見的。 2014-08-14 5個12_5擴(kuò)增失敗.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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PCR擴(kuò)增時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對策 凌波麗 2013年8月23日總結(jié)（第二次修訂，加上序號，使文章的層次清晰，另外修正了錯漏之處） 2013年10月9日凌晨第三次修改補(bǔ)充。 PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差或酶的專一性不夠，DNA模板量過大，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多，模板長于3kb所引起。 其對策有： 1.減少酶量（一般以2單位Taq DNA聚合酶為基點，分梯度上下調(diào)一調(diào)，其他酶也差不多如此濃度，可以參考說明書）；加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性或調(diào)換另一來源的專一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的專一性。 （1）改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油，若此操作引起酶的濃度過高，可以適當(dāng)加雙蒸餾水稀釋。 （3）為了加強(qiáng)Taq DNA聚合酶的專一性。 的專一性，可在反應(yīng)體系中加入：1-1.5mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以增加Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。 3.適當(dāng)減少dNTP的濃度；減少dNTP的濃度一般需要與降低Mg2+濃度同方向偶聯(lián)進(jìn)行，但是不必按同樣的比例。 4.適當(dāng)降低Mg2+濃 度，可以采用梯度遞減方式，以每次0.5mol/L遞減，但是Mg2+的終濃度不要低于1.0mol/L。 5. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計引物之前，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，非特異性擴(kuò)增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 7.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。使用熱啟動模式。使用熱啟動時可以購買商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購買。 8. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 9.以上措施都不行時，最后就只能重新設(shè)計引物，加強(qiáng)引物的專一性。 10.適當(dāng)減少DNA模板量。 11.適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，一般也就循環(huán)25次就差不多了。 12.如果樓主的PCR模板是3kb或者更大，用普通PCR效果大概不會很理想，應(yīng)該考慮使用Long-Range PCR。 樓主三次的實驗流程和試劑一樣，但這次效果如此不好，我個人認(rèn)為：首先考慮酶的質(zhì)量、模板質(zhì)量（放久了模板也可能發(fā)生降解，尤其是反復(fù)凍融）、其他的試劑的質(zhì)量，實際操作是不是失準(zhǔn)等問題（可能一些操作細(xì)節(jié)由于以前的成功，所以這次比較放松了，實際的操作并不標(biāo)準(zhǔn)）等。 |
6樓2014-08-19 02:14:17
hufangzhou
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8樓2014-08-19 08:43:39
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