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windy6060銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)保守序列的選擇 已有1人參與
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| 本人從網(wǎng)上下載了6段序列經(jīng)DNAman同源比對(duì)后找保守序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物和探針,發(fā)現(xiàn)有很多個(gè)保守區(qū),但是每個(gè)保守區(qū)中的堿基都不多,長(zhǎng)的10來個(gè),短的2個(gè)左右,若是根據(jù)擴(kuò)增的序列在100到150之間的話,需要橫跨好幾個(gè)保守區(qū),中間會(huì)夾雜一些非保守的堿基,請(qǐng)問我該怎樣選擇保守序列作為設(shè)計(jì)引物的模板序列?有一些選擇原則和去除原則嗎,謝謝! |
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1、2個(gè)堿基的保守區(qū)?這有點(diǎn)過分啊,這就不叫保守區(qū)了。 2、如果非要設(shè)計(jì)引物,建議在較長(zhǎng)的序列保守區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì),上下游引物設(shè)計(jì)在臨近或間隔的序列保守區(qū)內(nèi)都沒有問題,保守區(qū)的長(zhǎng)度最少也要十幾bp,再短的話引物的tm就不夠了。不要在考慮引物二聚體、二級(jí)結(jié)構(gòu)的問題了,先找到引物的結(jié)合區(qū)吧,其余的問題都是小節(jié) 3、引物的端區(qū)域設(shè)計(jì)在保守區(qū),5端如果不能落在保守區(qū),也不要出去太多,所以保守區(qū)序列越長(zhǎng)越好。如果5端不在保守區(qū),pcr的時(shí)候需要降低退火溫度。 |
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