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Young-Tiger金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
連接載體一直連不上 已有2人參與
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| 插入片段450bp，要連接的載體有7kb左右，一端平（StuI）一端粘（Bsu36I），濃度設(shè)置上，載體：50ng，載體插入片段摩爾比是1：3；連接酶，NEB的5min Quick Ligase 和promega的3h T4都用過(guò)了，還是沒(méi)長(zhǎng)出來(lái)。昨天一個(gè)關(guān)鍵的對(duì)照是，我用同樣的插入片段同樣的酶切位點(diǎn)連一個(gè)較小的載體（3kb pGEM）連接成功，所以問(wèn)題總結(jié)后就是，同一個(gè)插入片段連小載體成功連大載體失敗，請(qǐng)高手指點(diǎn)該怎么改進(jìn)。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2014-10-19 18:20:39
Young-Tiger: 金幣+25, ★有幫助 2014-10-20 20:57:56
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| 樓主的載體最好也要有個(gè)positive control，保證閉環(huán)的載體轉(zhuǎn)然后可以長(zhǎng)出菌落。然后樓主可以試試提高插入片段的比例，片段載體比可以提高到20:1，別擔(dān)心出現(xiàn)串聯(lián)插入，雙酶切出現(xiàn)串聯(lián)插入的可能性很小。祝連接成功！ |
2樓2014-10-18 00:26:53
Young-Tiger
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3樓2014-10-18 01:07:03
4樓2014-10-18 10:45:32
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5樓2014-10-18 22:31:54
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