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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » DNA重組 » 連接載體一直連不上
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Young-Tiger金蟲 (小有名氣)
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連接載體一直連不上 已有2人參與
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| 插入片段450bp，要連接的載體有7kb左右，一端平（StuI）一端粘（Bsu36I），濃度設置上，載體：50ng，載體插入片段摩爾比是1：3；連接酶，NEB的5min Quick Ligase 和promega的3h T4都用過了，還是沒長出來。昨天一個關鍵的對照是，我用同樣的插入片段同樣的酶切位點連一個較小的載體（3kb pGEM）連接成功，所以問題總結后就是，同一個插入片段連小載體成功連大載體失敗，請高手指點該怎么改進。 |
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Young-Tiger
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5樓2014-10-18 22:31:54
【答案】應助回帖
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| 樓主的載體最好也要有個positive control，保證閉環(huán)的載體轉然后可以長出菌落。然后樓主可以試試提高插入片段的比例，片段載體比可以提高到20:1，別擔心出現(xiàn)串聯(lián)插入，雙酶切出現(xiàn)串聯(lián)插入的可能性很小。祝連接成功！ |
2樓2014-10-18 00:26:53
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3樓2014-10-18 01:07:03
4樓2014-10-18 10:45:32
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