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半島鐵盒l(wèi)sf

新蟲 (小有名氣)

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[求助] 反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)不出目的條帶已有7人參與

最近剛開始自己的實(shí)驗(yàn)，只有一個(gè)細(xì)胞株，想要從這個(gè)細(xì)胞株里提RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)出需要的目的基因序列。反轉(zhuǎn)錄后PCR用了GAPDH的引物做對照，GAPDH能夠擴(kuò)出來，但是需要的目的基因條帶一直擴(kuò)不出來，條帶都沒有。模板、引物、酶量、溫度梯度都試過，一直失敗中，希望大家多給指點(diǎn)指點(diǎn)，求分享經(jīng)驗(yàn)！另外，如果我需要其他的目的基因序列，能也從這個(gè)細(xì)胞株里相同方法得到嗎？謝謝

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怎么擴(kuò)不出來已經(jīng)有7人回復(fù)

1樓 2014-11-11 11:09:47

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koujie1986

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擴(kuò)不出來原因有很多，需要逐步排查原因。我覺得可以考慮先找其他質(zhì)量可以的cDNA看看你的引物質(zhì)量如何，如果引物設(shè)計(jì)有問題怎么擴(kuò)都不會有帶的。其次，先弄清楚該基因在你那個(gè)細(xì)胞株里面表不表達(dá)，表達(dá)時(shí)間等等。再次，RNA提取質(zhì)量要有保證，這樣反轉(zhuǎn)錄效率才高，模板質(zhì)量有保證。

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3樓2014-11-11 14:49:47

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shoufangche

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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:36:04

GAPDH能夠擴(kuò)出來說明你的DNA模版是沒有問題的，是引物序列不合適吧

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2樓2014-11-11 12:27:23

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引用回帖:

2樓: Originally posted by shoufangche at 2014-11-11 12:27:23
GAPDH能夠擴(kuò)出來說明你的DNA模版是沒有問題的，是引物序列不合適吧

因?yàn)檫€有定量PCR的引物，就用定量PCR的引物也在普通PCR儀上試了試，也是出不來。就在想是不是提的RNA降解了，或者細(xì)胞本身表達(dá)那個(gè)蛋白還是有點(diǎn)少。所以打算跑膠再看看RNA，另外重新問別人要到另一個(gè)細(xì)胞株提的RNA，想一起跑膠看看再試試能不能P出來。

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4樓2014-11-11 20:18:33

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引用回帖:

3樓: Originally posted by koujie1986 at 2014-11-11 14:49:47
擴(kuò)不出來原因有很多，需要逐步排查原因。我覺得可以考慮先找其他質(zhì)量可以的cDNA看看你的引物質(zhì)量如何，如果引物設(shè)計(jì)有問題怎么擴(kuò)都不會有帶的。其次，先弄清楚該基因在你那個(gè)細(xì)胞株里面表不表達(dá)，表達(dá)時(shí)間等等。再次 ...

我現(xiàn)在資源有限，木有可用的cDNA ，所以為了獲得我的基因序列才用反轉(zhuǎn)錄。另外一對引物訂出去了。想問一下如果只是低表達(dá)是不是就很難擴(kuò)出來？表達(dá)時(shí)間是怎么來判斷的？O(∩_∩)O謝謝

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5樓2014-11-11 20:24:04

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