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[求助]
克隆基因克隆不出來，請各位老師同學(xué)看看什么問題。 已有4人參與
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各位老師好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。師兄從NCBI查找的序列，設(shè)計了12對引物（12個功能結(jié)構(gòu)域相似的基因），我用各種處理的（高溫，低溫，乙醇，鹽）CDNA模板跑pcr，一共只有4對引物跑出了條帶，但是大都與查找的序列不對應(yīng)，我使用的是諾唯贊的mix酶。 回收條帶后連接pud19-T載體，過夜培養(yǎng)后挑出單克隆，拿去測序，比對率都在25%左右。 不只是哪里出現(xiàn)了問題，跑PCR的時候就是按照師兄給的條件跑的：94 3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循環(huán));4 正無窮。 第一次發(fā)帖，也沒什么經(jīng)驗，不知道說清楚沒有，金幣也沒多少，所以還請各位老師同學(xué)見諒，幫幫我！ |
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zshw_001
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秦始皇faq(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-11-25 13:16:46
| 測序結(jié)果比對不正確，估計是因為你引物設(shè)計的不特異，沒有擴(kuò)增出你的目的基因；也可能是因為你本身從NCBI上查找的序列就不正確，從而導(dǎo)致引物設(shè)計不正確。另外你其他的8個目的片段擴(kuò)增沒有條帶，建議你提高一下退火溫度。我之前用過諾唯贊的phanta mix酶，擴(kuò)增效率挺高的，不知道你用的是不是這個酶。如果你的GC含量高的話可以加入Enhance，能夠更好地擴(kuò)增出目的片段。祝實驗順利 |
6樓2014-11-25 09:29:27
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