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pMT-bip-GFP轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá) 已有1人參與
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最近在做果蠅的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，無(wú)法檢測(cè)到蛋白的表達(dá)。 Axygen的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pIEX-1-GFP和pMT-Bip-GFP的質(zhì)粒，濃度約為500ng/ul左右。 使用cellfectin II和Qiagen的effectence同時(shí)對(duì)pMT-bi-GFP和pIEX-1-GFP進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞稀釋至1*10^6 cell/ml。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，cellfecin II和effectence都能成功轉(zhuǎn)染pIEX-1-GFP，雖然轉(zhuǎn)染效率不高（~20%），但有發(fā)熒光的細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染一天后，對(duì)轉(zhuǎn)染pMT-bi-GFP的細(xì)胞加入10ul 100mM的CuSO4溶液至2ml培養(yǎng)基，至終濃度為500uM。 100mM CuSO4的配制為，0.25g溶解到10mL的雙蒸水。硫酸銅用的是 sigma C8027 ，http://www.sigmaaldrich.com/cata ... h®ion=CN 1d后未見(jiàn)發(fā)熒光細(xì)胞，直至4d后也未見(jiàn)熒光細(xì)胞后培養(yǎng)基熒光亮度增強(qiáng)（相對(duì)于對(duì)照）。收集上清和細(xì)胞，上清加入merk 的4*binding buffer至1*，純化洗脫后，跑膠�？筯is標(biāo)簽的單抗，western檢測(cè)也未見(jiàn)條帶，遺憾的是未做陽(yáng)性對(duì)照。 對(duì)pMT-bip-GFP用測(cè)序引物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下： cgagagcatctggccaatgtgcatcagttgtggtcagcagcaaaatcaagtgaatcatctcagtgcaactaaagggggga tccgatctcaatatgaagttatgcatattactggccgtcgtggcctttgttggcctctcgctcgggagatctccatggcc cggggtaccggtagaaaaaatggctagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatg gtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgctacatacggaaagcttacccttaaattt atttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccg ttatccggatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctt tcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatcgtatcgagttaaaa ggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcac ggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcag accattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtcgacacaatctgcc ctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcat ggatgatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtc tcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctaag gcctgagctcgctgatcagcctcgatcgaggatccagacatgatagatac 和公布的序列有一個(gè)堿基的差異，但翻譯結(jié)果沒(méi)有受到影響。 另一點(diǎn)是，pIEX-1-GFP中的GFP和pMT-bip-GFP里的不一樣，pMT-bip-GFP是Cycle 3-GFP,pIEX-1-GFP里的是eGFP，序列為： MAHHHHHHHHHHSSGKETAAAKFERQHMDSPPPSGLVPRGSAGSGTIDDDDKSPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGH KFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGN YKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK. 顯微鏡的型號(hào)是Nikon DS-Ri1 光柵是 EX 450-490 DM 505 BA 520 只有這么多金幣了  ~愿散盡贊個(gè)人品……請(qǐng)過(guò)路的各位兄弟姐妹幫忙解救~！不甚感激~！ |
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