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zzlei金蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白過鎳柱，出現(xiàn)大量沉淀，請教各位 已有1人參與
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破碎離心完之后推濾了一下，然后過鎳柱，分別用20mL 20mM咪唑（25mM Tris，100mM NaCl)、80mM咪唑、150mM咪唑、350mM咪唑、500mM咪唑洗脫，發(fā)現(xiàn)自150mM就能洗出目的蛋白，但雜蛋白也很多。350mM洗脫時蛋白發(fā)生沉淀，且15mL的量基本能把柱子里的蛋白全洗脫下來，500時基本就什么都沒有了。 試著將350的沉淀用硫酸銨溶解，但效果不好，透析用25mM Tris，300mM NaCl，仍然沉淀揮之不去。透析一直在4℃下攪拌進(jìn)行。請教各位高手們，是咪唑濃度太高導(dǎo)致了沉淀？沉淀的蛋白是因?yàn)樽冃远鵁o法再溶解？透析液我分別調(diào)了100mM NaCl、200mM、300mM，還適當(dāng)加了5%、10%甘油試著溶解沉淀，但都沒有效果。希望大家?guī)臀曳治鲆幌碌降资鞘裁丛蛞鸬�。純化N多次了，每次都是350的咪唑就沉淀了 |
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那個蛋白透析時將鹽濃度調(diào)到20mM、100mM、200mM、300mM試了，都不行，難道是因?yàn)橹耙呀?jīng)沉淀變性了無法再溶解了？ 最近又換做了另一個蛋白，這個蛋白師兄們做都沒有問題，很純，表達(dá)量也很高，但我一做又出現(xiàn)類似上述的問題。他們說350咪唑時有一部分蛋白，但從未出現(xiàn)過沉淀，500時能收到很純的。但我的基本都在350洗下來了，而且基本全部沉淀了。500里面也有，也渾濁著。。。 同樣試著換了鹽濃度，還是沒效果。 是不是我操作過程哪兒出問題了？導(dǎo)致在過程中蛋白就變性了？記得以前溶菌超聲離心完后得到的蛋白清液基本都是透明的，但現(xiàn)在每次得到的都看著很渾濁。之前我還以為是蛋白表達(dá)量很高的原因。 是不是我超聲過程出問題了？溶菌用的20mM hepes，得到80mL,分兩次超聲，每次20~30min |
10樓2015-02-01 08:56:47
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