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zhou325912銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切怎么操作才能完全徹底呢！ 已有7人參與
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我現(xiàn)在正在做雙酶切連接，用的是NcoI和PstI這兩個(gè)酶，首先我是將連有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后將新的片段經(jīng)雙酶切之后連入目的載體（新片段和原來質(zhì)粒上的片段大小一樣，片段1.5kb，質(zhì)粒剩下部分為6.8kb）轉(zhuǎn)化有轉(zhuǎn)化子，菌落PCR驗(yàn)證正確，但是拿了8個(gè)轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)全是之前的那個(gè)舊質(zhì)粒，現(xiàn)在懷疑是質(zhì)粒雙酶切沒有切完全，請(qǐng)問我應(yīng)該怎么操作才能盡可能保證酶切完全呢 已經(jīng)糾結(jié)了很長(zhǎng)時(shí)間了，求大神指點(diǎn) |
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Lylissa
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-03-10 10:39:04
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-03-10 10:39:04
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雙酶切之后先跑膠看看是否已經(jīng)完全酶切，若沒有就繼續(xù)切，如完全切開了就低電壓長(zhǎng)時(shí)間跑膠，分離，回收再連接。 鑒定的時(shí)候，找一個(gè)目的片段里面有但原來那個(gè)1.5KB片段沒有的酶切位點(diǎn)+載體上的酶切位點(diǎn)雙酶切看看是否與自己分析的一致。一致就測(cè)序，不一致就錯(cuò)，不用PCR，麻煩。即使PCR，還是要酶切，麻煩。 是否看懂？ |
4樓2015-03-09 16:52:16
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