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質(zhì)粒分別酶切均有正確條帶，但雙酶切只有一條條帶，這是怎么回事？ 已有3人參與
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我的片段長度為5400bp左右，連接到POK12載體，載體長度為2400bp。由于長片段連接太難，所以我將片段一分為二，分別為3200bp和2600bp。分別連接入pok中。再將兩段連接起來。經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。片段1的雙酶切為MluI和NdeI，片段2的雙酶切為NdeI和EcoRV；同時(shí)使用MluI和EcoRV對整個(gè)片段進(jìn)行酶切。第一行為片段1的雙酶切，第二行為片段2的雙酶切，均有目的條帶，第三行為整個(gè)片段的酶切，但是沒有pok質(zhì)粒條帶，只有單一的一條帶，三個(gè)酶切使用的是同一個(gè)質(zhì)粒，請問這是怎么回事？我到底是連上了還是沒連上啊……請大家?guī)兔匆幌路治鲆幌缕渲械膯栴}。Marker從上到下的大小為5000，3000，2000，1500，800，500，300 20150318-2.jpg |
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whdxhxy
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-03-19 15:31:26
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Double Digest Recommendations for MluI + NdeI: Digest in NEBuffer 3.1 at 37°C. 如果用NEB的酶，以后雙酶切，先在以下網(wǎng)站找用哪個(gè)buffer. http://international.neb.com/too ... ouble-digest-finder 如果換成Fermentas的酶，是只有一個(gè)buffer的，就不用擔(dān)心雙酶切buffer不合適。 |
5樓2015-03-19 11:25:35
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