海底剛琴

銀蟲 (小有名氣)

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[求助] 構(gòu)建載體PCR結(jié)果和測(cè)序結(jié)果不一樣已有3人參與

最近構(gòu)建了一個(gè)克隆載體，目的基因2000多bp插入到pCMV載體上，在培養(yǎng)基上挑了單克隆 ,搖菌提質(zhì)粒，用目的基因的上下游引物去pcr質(zhì)粒，跑膠有2000多的條帶出現(xiàn)，之后將質(zhì)粒送去測(cè)序，使用通用引物，測(cè)通，結(jié)果卻是只有1000左右的序列，而且和目的基因不能匹配。重復(fù)倆次，結(jié)果都是這樣，兩次測(cè)序結(jié)果只有下游兩三個(gè)堿基不一樣其他都一樣。出現(xiàn)這種情況讓我想不通，希望大家能幫助一下，給個(gè)合理的解釋。

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生活總是有那么多門檻，一口氣跨過(guò)去就好了。

1樓 2015-04-06 18:32:04

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人車

木蟲 (正式寫手)

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我現(xiàn)在也是出現(xiàn)了這樣的問(wèn)題我的PCR產(chǎn)物開(kāi)始送出去測(cè)序比對(duì)是正確的但是之后重組質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化之后做菌落PCR用的是我的特異性引物以及載體的通用引物也都出來(lái)目的基因大小的片段不過(guò)送出去測(cè)序就是細(xì)碎我現(xiàn)在也想不通準(zhǔn)備再找一個(gè)測(cè)序公司試一下想問(wèn)一下樓主找出問(wèn)題在哪里了嗎？

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2樓2015-04-08 10:52:10

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王平陽(yáng)

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由于測(cè)序結(jié)果只有800 bp左右序列是準(zhǔn)確可信的，所以一般測(cè)序公司只給出1000 bp左右的測(cè)序結(jié)果，要想測(cè)通，可以向測(cè)序公司提出或者自己在中間設(shè)計(jì)引物，引物序列提供給測(cè)序公司，要求合成并用通用引物及特異引物多次測(cè)序，從而拼接出正確序列，此外還需要加大送樣量。

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沒(méi)有做不到，只有想不到！

3樓2015-04-08 11:17:09

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墨爾本機(jī)器

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-04-09 08:25:46

樓主如果描述問(wèn)題沒(méi)有錯(cuò)誤的話，感覺(jué)是你自己的特異性引物污染了，可以做一下無(wú)模板對(duì)照看看有沒(méi)有條帶。建議你用通用引物上游和特異性引物下游鑒定你的結(jié)果。測(cè)序可能性也有，很小。
實(shí)在不行就直接送PCR產(chǎn)物吧，帶要純！

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4樓2015-04-08 19:42:43

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王冠傑

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如果確定是收到的拼接結(jié)果的話只能是前期構(gòu)建的問(wèn)題了。。。。。。。建議將質(zhì)粒PCR的產(chǎn)物送去測(cè)序，一步步縮小范圍一一排查

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5樓2015-05-10 16:51:28

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