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ggyy0911鐵蟲 (正式寫手)
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[交流]
測序正確的片段雙酶切連接表達(dá)載體，提質(zhì)粒PCR驗(yàn)證后，還需要再次測序嗎？
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我做的是表達(dá)，照理應(yīng)該測序確定一下，不過之前對雙酶切太信任了，我切膠回收又從來不用紫外，都是肉眼看著徒手切。感覺沒有什么能讓片段變化的因素。 但是最近單酶切的一個樣品送去測序，連的片段已經(jīng)測序正確了，pcr鑒定用的是上游特異性引物，下游通用引物，pcr條帶大小正確，但是測序居然連反了……而且末端有三個單點(diǎn)突變……突變可能是測序錯誤，我一看反了也沒有再細(xì)看。但是連反了是什么鬼！ 我還有六個樣品，是雙酶切連接的，在克隆載體上測序正確，然后連了表達(dá)載體，提質(zhì)粒pcr鑒定，上下游引物分別是特異性引物和通用引物，條帶大小正常，而且每個樣挑的三個單克隆條帶大小相同。這是不是意味著這三個樣我可以隨便用呢？網(wǎng)上沒有關(guān)于這個的討論，我心里挺沒底的，做過的同學(xué)都來說一說吧。 |
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5樓2015-04-08 09:16:19
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