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ggyy0911鐵蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
測(cè)序正確的片段雙酶切連接表達(dá)載體，提質(zhì)粒PCR驗(yàn)證后，還需要再次測(cè)序嗎？
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我做的是表達(dá)，照理應(yīng)該測(cè)序確定一下，不過(guò)之前對(duì)雙酶切太信任了，我切膠回收又從來(lái)不用紫外，都是肉眼看著徒手切。感覺(jué)沒(méi)有什么能讓片段變化的因素。 但是最近單酶切的一個(gè)樣品送去測(cè)序，連的片段已經(jīng)測(cè)序正確了，pcr鑒定用的是上游特異性引物，下游通用引物，pcr條帶大小正確，但是測(cè)序居然連反了……而且末端有三個(gè)單點(diǎn)突變……突變可能是測(cè)序錯(cuò)誤，我一看反了也沒(méi)有再細(xì)看。但是連反了是什么鬼！ 我還有六個(gè)樣品，是雙酶切連接的，在克隆載體上測(cè)序正確，然后連了表達(dá)載體，提質(zhì)粒pcr鑒定，上下游引物分別是特異性引物和通用引物，條帶大小正常，而且每個(gè)樣挑的三個(gè)單克隆條帶大小相同。這是不是意味著這三個(gè)樣我可以隨便用呢？網(wǎng)上沒(méi)有關(guān)于這個(gè)的討論，我心里挺沒(méi)底的，做過(guò)的同學(xué)都來(lái)說(shuō)一說(shuō)吧。 |
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xiaochong8693
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4樓2015-04-08 08:33:32
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