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[求助] PCR產(chǎn)物加尾之后連接載體的問題已有5人參與

使用TOYOBO公司的KOD FX酶擴(kuò)增大約2.5kb的目的片段，由于要連到PMD-19T載體上，需要對(duì)PCR產(chǎn)物加尾。以下是我的實(shí)驗(yàn)步驟，請(qǐng)教一下有沒有問題：
①PCR產(chǎn)物跑膠后切膠回收；②將回收的產(chǎn)物使用rTAQ酶體系72℃水浴保溫30min加尾，③加尾后的產(chǎn)物4ul，soultion I 5ul，PMD-19T simple 1ul，混合后16℃水浴過夜。連接之后的產(chǎn)物跑膠后發(fā)現(xiàn)片段大小只是原來擴(kuò)增的片段，請(qǐng)問是哪里出問題了？

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1樓 2015-05-11 21:53:15

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連接完直接轉(zhuǎn)化啊，跑什么膠啊。長出菌落再檢測就好了，出不出全憑信仰，只要有一個(gè)陽性克隆就是勝利

你連接個(gè)T載體都這么小心謹(jǐn)慎的，以后就是要把自己逼死的節(jié)奏啊

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11樓2015-05-13 11:36:57

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????K????????z??????A???????????PCR?w????Aβ

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2樓2015-05-11 22:46:06

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鏈接之后的產(chǎn)物跑膠？是指連接PMD-19T載體之后跑膠大小還是加尾后跑膠啊，鏈接載體后跑膠，引物不變擴(kuò)增的片段當(dāng)然不變了

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3樓2015-05-12 09:08:01

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連接后10ul的體系做檢測還能檢測出基因那說明LZ的基因濃度不低，那跑膠能看到T載體的帶嗎？
其實(shí)我建議LZ就拿這個(gè)體系做一下轉(zhuǎn)化試試運(yùn)氣，因?yàn)楸旧碓诔Ｒ?guī)buffer下rTaq加A效率就不高，估計(jì)有連上T載體的但是達(dá)不到瓊脂糖凝膠的分辨率你肉眼看不到而已，連出來空載可能會(huì)比較多。
要想提高rTaq的加A效率，可以把dNTP換成dATP，用rTaq，其他體系不變，連接72度30min——60min。

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4樓2015-05-12 16:56:42

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???????:

2?: Originally posted by ?????11 at 2015-05-11 22:46:06
????K????????z??????A???????????PCR?w????Aβ

?????PCR?????β????

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5樓2015-05-12 22:59:18

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3樓: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-12 09:08:01
鏈接之后的產(chǎn)物跑膠？是指連接PMD-19T載體之后跑膠大小還是加尾后跑膠啊，鏈接載體后跑膠，引物不變擴(kuò)增的片段當(dāng)然不變了

是加尾后的PCR產(chǎn)物與PMD-19T載體連接之后的產(chǎn)物跑膠。連接產(chǎn)物不是直接跑膠看大小是否符合預(yù)期嘛？還要再擴(kuò)增嗎？

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6樓2015-05-12 23:07:32

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4樓: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-12 16:56:42
連接后10ul的體系做檢測還能檢測出基因那說明LZ的基因濃度不低，那跑膠能看到T載體的帶嗎？
其實(shí)我建議LZ就拿這個(gè)體系做一下轉(zhuǎn)化試試運(yùn)氣，因?yàn)楸旧碓诔Ｒ?guī)buffer下rTaq加A效率就不高，估計(jì)有連上T載體的但是達(dá)不到 ...

嗯，好的，謝謝！做轉(zhuǎn)化看看

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7樓2015-05-12 23:08:18

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7樓: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:08:18
嗯，好的，謝謝！做轉(zhuǎn)化看看...

用30ul連接產(chǎn)物和200ul感受態(tài)細(xì)胞混合涂版，可能會(huì)有很多T載體的自連，所以挑轉(zhuǎn)化子的時(shí)候多挑一些，拼你運(yùn)氣的時(shí)候到了~~
如果沒有陽性轉(zhuǎn)化子，那就買dATP加A，一般的dNTP加A效果真心很差。

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8樓2015-05-12 23:23:07

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6樓: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:07:32
是加尾后的PCR產(chǎn)物與PMD-19T載體連接之后的產(chǎn)物跑膠。連接產(chǎn)物不是直接跑膠看大小是否符合預(yù)期嘛？還要再擴(kuò)增嗎？...

哦哦，我理解錯(cuò)了

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9樓2015-05-13 10:00:18

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直接平端載體嘛，費(fèi)這個(gè)勁干什么呢

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10樓2015-05-13 11:17:36

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