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xmccphx銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR產(chǎn)物加尾之后連接載體的問(wèn)題 已有5人參與
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使用TOYOBO公司的KOD FX酶擴(kuò)增大約2.5kb的目的片段，由于要連到PMD-19T載體上，需要對(duì)PCR產(chǎn)物加尾。以下是我的實(shí)驗(yàn)步驟，請(qǐng)教一下有沒(méi)有問(wèn)題： ①PCR產(chǎn)物跑膠后切膠回收；②將回收的產(chǎn)物使用rTAQ酶體系72℃水浴保溫30min加尾，③加尾后的產(chǎn)物4ul，soultion I 5ul，PMD-19T simple 1ul，混合后16℃水浴過(guò)夜。 連接之后的產(chǎn)物跑膠后發(fā)現(xiàn)片段大小只是原來(lái)擴(kuò)增的片段，請(qǐng)問(wèn)是哪里出問(wèn)題了？ |
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2樓2015-05-11 22:46:06
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3樓2015-05-12 09:08:01
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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連接后10ul的體系做檢測(cè)還能檢測(cè)出基因那說(shuō)明LZ的基因濃度不低，那跑膠能看到T載體的帶嗎？ 其實(shí)我建議LZ就拿這個(gè)體系做一下轉(zhuǎn)化試試運(yùn)氣，因?yàn)楸旧碓诔Ｒ?guī)buffer下rTaq加A效率就不高，估計(jì)有連上T載體的但是達(dá)不到瓊脂糖凝膠的分辨率你肉眼看不到而已，連出來(lái)空載可能會(huì)比較多。 要想提高rTaq的加A效率，可以把dNTP換成dATP，用rTaq，其他體系不變，連接72度30min——60min。 |
4樓2015-05-12 16:56:42
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