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[求助]
RNA提取時(shí)，濃度4252.2，A260/280=1.99，但電泳跑不出RNA，原因是？ 已有10人參與
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我在提取RNA時(shí)，取樣0.1g，新鮮樣品現(xiàn)磨，用的Trizol提取法。結(jié)果RNA的濃度可以，2.0>A260/280>1.8，A260/230>2.0。但跑膠時(shí)沒有RNA出現(xiàn)，只有點(diǎn)樣孔很亮，和DNA Marker條帶（圖1）。跑膠時(shí)采用點(diǎn)樣體系：DNA Loading Buffer、DNA Marker、Gel stain（核酸染料）各2ul，上樣量2ul。跑膠條件：U=100V、I 隨意，時(shí)間12min。出現(xiàn)問題之后，我采用大電泳槽電泳，電泳條件為：U=220V、I 隨意、時(shí)間15min。結(jié)果是RNA拖尾，DNA Marker更清楚（圖2）。請(qǐng)問這種問題可能是由于什么原因造成的？誰有好主意接下來我該做些什么測試才能找出問題和解決問題？謝謝！ 圖1.jpg 圖2.jpg |
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holyala
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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要是提個(gè)RNA都得做MRI，那做分子生物實(shí)驗(yàn)的同學(xué)們都要跪了。紫外分光光度計(jì)，電泳，RT-PCR個(gè)個(gè)都能證明提出來的是不是RNA。 樓主電泳沒跑好啊，第一個(gè)圖Marker都沒跑開就不說了，第二個(gè)圖Marker用的是啥？普通瓊脂糖膠跑RNA，最好用DL2000 DNA Marker，膠用0.8~1.2%，28S rRNA跑的位置和2000bp差不多。 前面有人答說上樣量太大，建議稀釋，我覺得很有道理。4.5ug/uL啊，這濃度！一般用個(gè)300-400ng跑電泳就能看得比較清楚了。 另外就是試試CTAB法，或者買個(gè)植物總RNA提取試劑盒。 |
20樓2015-05-19 10:41:35
小螞蟻蟲
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15樓2015-05-14 22:18:09
2樓2015-05-13 15:43:17
3樓2015-05-13 18:22:19
Neo2000
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4樓2015-05-13 18:28:00
依然自然5樓2015-05-13 19:25:12
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初提，很多不懂，就按程序走了一遍 看看哪里會(huì)錯(cuò)，后面好加以注意。你說的沒提出來，是看膠就能看出來的是不？我提的步驟： 1.取0.1g新鮮葉片，液氮研磨，加1ml Trizol于研缽中，待快溶解時(shí)再研磨，后將研磨液移至預(yù)冷離心管，加200ul氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置10min，13000r/min、4、15min。 2.移上清，加500ul預(yù)冷的異丙醇，劇烈震蕩15s、4、靜置10min。4、13000r/min、10min。 3.棄上清，加500ul 75%乙醇，上下震蕩15s，4、13000r/min、15min。 4.棄上清，風(fēng)干75%乙醇，加100ulDEPC-water 55 溶解5min. 5.加130ul 酸性酚，4、13000r/min、15min。 6.移上清至新離心管，加入等體積氯仿，4、13000r/min、15min。 7.移上清至新離心管，加1/10體積的NaAc、2倍體積的100%乙醇，4、13000r/min、15min。 8.棄上清，加500ul 75%乙醇，上下震蕩15s，4、13000r/min、15min。 9.棄上清，風(fēng)干75%乙醇，加10ulDEPC-water 55 溶解5min. 10.取2ul測濃度，2ul點(diǎn)樣。 以上是我的實(shí)驗(yàn)過程，麻煩幫我看看哪里出錯(cuò)了？我提的是多酚多糖類植物的葉片RNA。 謝謝指點(diǎn)！ |
6樓2015-05-13 19:42:35
7樓2015-05-13 19:49:46
luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
依然自然(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-05-15 19:34:31
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
依然自然(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-05-15 19:34:31
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1.提取RNA的時(shí)候RNA的顏色有沒有變深？ 2.如果真是多糖多酚污染的話，聽說有一種CTAB提植物RNA的方法，LZ可以去查一查。 3.其實(shí)可能最簡便的解決方法就是把你現(xiàn)在提取樣品稀釋個(gè)100倍再跑個(gè)膠看看，你提的濃度那么大，隨便混雜點(diǎn)多酚沉淀就把你點(diǎn)樣孔給堵了，先先稀釋了跑一下看看能不能跑出孔，如果實(shí)在是你RNA全給結(jié)合了話只有試一試專門的試劑盒了！~你的提取方法是沒有問題的 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
8樓2015-05-13 20:20:20
mataomatao
禁蟲 (正式寫手)
9樓2015-05-13 20:25:25
10樓2015-05-14 09:46:05
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