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zhangjie2005木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
大分子蛋白的原核表達(dá) 已有1人參與
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| 本人初涉蛋白表達(dá)領(lǐng)域，要做的蛋白分子較大，有900個(gè)氨基酸，看文獻(xiàn)中是先做一下蛋白可溶性分析和免疫原性分析，然后再做部分片段的原核表達(dá)。想請(qǐng)問(wèn)一下應(yīng)該怎么做這兩種分析？用什么軟件？跪謝！ |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhangjie2005: 金幣+5, ★有幫助 2015-05-20 17:33:34
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蛋白的可溶性分析通常是用SDS-PAGE來(lái)做，具體操作如下： 誘導(dǎo)表達(dá)后，12000 rpm離心1 min收獲菌體，50 mL菌液沉淀用5 mL結(jié)合緩沖液重懸，經(jīng)超聲波充分破碎后離心，沉淀重懸于1/10 體積的結(jié)合緩沖液中，分別取上清及沉淀進(jìn)行電泳分析。取1.5ml誘導(dǎo)后的菌液，離心后將菌體重懸于100 ul Buffer A中，冰浴30分鐘。離心收集菌體，上清即為周質(zhì)蛋白部分，沉淀重懸于0.1mol/L Tris-HCl（PH8.0）溶液中，凍融破碎細(xì)胞，離心，上清為胞質(zhì)部分，沉淀部分為不溶性包涵體和細(xì)胞膜組分。將各組分加入SDS-PAGE樣品緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。 結(jié)合緩沖液: 0.5 mol/LNaCl，20 mmol/L Tris•Cl，2 mmol/L ZnCl2，5 mmol/L咪唑，PH7.5 Buffer A: 1mg/ml 溶菌酶、20% 蔗糖、30 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，PH8.0. 注意大分子蛋白表達(dá)時(shí)很容易降解 免疫原性檢測(cè)可以用Western Blot來(lái)做 |
2樓2015-05-20 11:40:50
zhangjie2005
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3樓2015-05-20 17:32:39
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嗯，因?yàn)槲抑饕獜氖碌氖?a href="http://www.gaoyang168.com/bbs/url.php?s=aHR0cDovL3d3dy5kZXRhaWJpby5jb20vcHJvdGVpbi1leHByZXNzaW9uLWRhbmJhaWJpYW9kYS5odG1s&_s=f194b10bfd01911f#opennewwindow" target="_blank" rel="nofollow">蛋白表達(dá)的下游實(shí)驗(yàn)部分，所以對(duì)上游的分析做的比較少，我找同事問(wèn)了一下，他們給我一個(gè)網(wǎng)址，你可以到上面對(duì)你的蛋白進(jìn)行一下測(cè)試。祝你成功 http://mips.helmholtz-muenchen.de/proso/proso.seam |
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zhangjie20054樓2015-05-21 09:18:31
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5樓2015-05-21 20:00:17
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